热休克蛋白27对宰后牛肉肌原纤维蛋白降解的调控机制研究

摘要

细胞凋亡酶和钙激活酶等肌肉内源酶对肌原纤维蛋白的有限降解是成熟过程中嫩度改善的主要原因。小分子热休克蛋白作为一类重要的凋亡调节因子，其在成熟过程中的变化与嫩度变化之间存在显著相关性，可能是宰后嫩度变化的一个关键调控因子，但其机制并不明确。本论文主要研究热休克蛋白27对牛肉成熟过程中细胞凋亡酶和钙激活酶活性及其对肌原纤维蛋白降解的影响;结合蛋白质组定量分析，检测热休克蛋白27可能参与调控嫩度的代谢途径;探讨氧化条件对热休克蛋白27调控肌原纤维蛋白降解的影响。通过以上研究可为进一步完善宰后肌肉成熟机制提供理论依据。具体研究内容和结果如下:
　　热休克蛋白27对牛肉成熟过程中肌原纤维蛋白降解的影响
　　本部分试验主要通过使用外源性热休克蛋白27对宰后牛肉进行处理，借助SDS-PAGE和Western-blotting检测细胞凋亡酶-3、μ-钙激活酶以及肌原纤维蛋白降解变化。结果表明外源性热休克蛋白27在宰后的前3天抑制肌间线蛋白和肌钙蛋白-T的降解，但处理5天后的样品与未处理样品无显著差异。免疫共沉淀结果表明，热休克蛋白27可与细胞凋亡酶-3、μ-钙激活酶结合。且外源性热休克蛋白27处理明显降低了细胞凋亡酶-3和μ-钙激活酶的降解和活性。综上所述，热休克蛋白27可能是通过抑制细胞凋亡酶-3、μ-钙激活酶活性而延缓肌原纤维蛋白的降解。
　　热休克蛋白27对细胞凋亡酶和钙激活酶体外降解肌原纤维蛋白的影响
　　本部分试验主要研究细胞凋亡酶和钙激活酶对肌原纤维蛋白的体外降解以及热休克蛋白27对这种降解的影响。结果表明，细胞凋亡酶-3能够在体外降解伴肌球蛋白、伴肌动蛋白和肌钙蛋白-T，而外源性热休克蛋白27对这种降解具有明显抑制作用;μ-钙激活酶加快了肌钙蛋白-T和肌间线蛋白的降解，热休克蛋白27的添加抑制了其降解;单独的外源性热休克蛋白27对肌原纤维蛋白的降解无显著影响。因此热休克蛋白27可抑制细胞凋亡酶和钙激活酶对肌原纤维蛋白体外降解。
　　热休克蛋白27封阻剂对牛肉成熟过程中蛋白质组定量表达的影响
　　本部分试验主要通过添加热休克蛋白27的封阻剂，利用TMT蛋白组学方法分析热休克蛋白27封阻前后不同成熟时间内的差异蛋白。结果共检测到992个差异蛋白，其中597个差异蛋白与嫩度相关，主要富集在myofibril(肌原纤维)，contractile fiber(收缩纤维)，extracellular regin(细胞外区域)，s arcomere(肌节)，I band(I带)，Z disc(Z线)，A band(A带)。可能参与的信号通路主要为Oxidative phosphorylation(氧化磷酸化)，Calcium signaling pathway(钙信号传导途径)。
　　氧化对热休克蛋白27调控肌原纤维蛋白降解的影响
　　本部分试验主要通过模拟氧化环境，探究氧化对热休克蛋白27调控肌原纤维蛋白降解的影响。结果发现，氧化抑制了肌钙蛋白-T的降解，对肌间线蛋白降解无明显影响;氧化对细胞凋亡酶-3活性无显著影响，而降低了μ-钙激活酶的活性。通过免疫荧光定位，发现氧化加快了热休克蛋白27和细胞色素c由细胞质移位到细胞膜和释放到细胞外。因此，氧化条件下热休克蛋白27可加速释放，降低μ-钙激活酶活性，影响细胞凋亡酶-3上游的激活过程，从而延缓成熟过程。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 内源酶与嫩度

1．2 小分子热休克蛋白的结构与功能

1．2．1 小分子热休克蛋白的结构

1．2．2 稳定细胞骨架

1．2．4 抑制细胞凋亡

1．3 小分子热休克蛋白在成熟过程中的作用

1．3．2 小分子热休克蛋白调控宰后牛肉嫩度的潜在机制

1．3．3 pH值对小分子热休克蛋白调控作用的影响

1．3．3 氧化对小分子热休克蛋白调控作用的影响

1．4 研究内容与技术路线

1．4．2 技术路线

第二章 热休克蛋白27对牛肉成熟过程中肌原纤维蛋白降解的影响

2．2．2 仪器与设备

2．2．3 试验方法

2．2．4 数据分析

2．3 结果与分析

2．3．3 热休克蛋白27与细胞凋亡酶-3，μ-钙激活酶的结合

2．3．4 细胞凋亡酶-3的活性及降解

2．3．5 μ-钙激活酶的活性及降解

2．4 本章小结

第三章 热休克蛋白27对细胞凋亡酶和钙激活酶体外降解肌原纤维蛋白的影响

3．1 引言

3．2 材料与方法

3．2．2 仪器与设备

3．2．4 数据分析

3．3 结果与分析

3．3．1 伴肌球蛋白的体外降解

3．3．3 肌钙蛋白-T的体外降解

3．3．4 肌间线蛋白的体外降解

3．5 本章小结

第四章 热休克蛋白27封阻剂对牛肉成熟过程中蛋白质组定量表达的影响

4．1 引言

4．2 材料与方法

4．2．2 仪器与设备

4．2．3 试验方法

4．3 结果与分析

4．3．3 差异蛋白GO富集分析

4．3．4 差异蛋白KEGG富集分析

4．3．5 基于聚类分析的部分蛋白的GO／KEGG分析

4．4 本章小结

第五章 氧化对热休克蛋白27调控肌原纤维蛋白降解的影响

5．1 引言

5．2 材料与方法

5．2．1 材料与试剂

5．2．2 仪器与设备

5．2．4 数据分析

5．3 结果与分析

5．3．2 肌钙蛋白-T的降解

5．3．3 肌间线蛋白的降解

5．3．4 细胞凋亡酶-3的活性和降解

5．3．5 钙激活酶的活性和降解

5．3．6 热休克蛋白27和细胞色素c的移位

5．4 本章小结

第六章 全文结论

6．1 研究总结

6．2 创新点

6．3 展望

参考文献

附录

致谢

作者简历