胸膜肺炎放线杆菌转录组学及yajC基因缺失株的生物学特性研究

摘要

胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae，App)为革兰阴性的小球杆菌，可引起猪传染性胸膜肺炎，乃集约化猪场常见传染病之一。
　　胸膜肺炎放线杆菌App6菌株，是本实验室前期分离于典型性猪传染性胸膜肺炎病例、血清型为5b型的强毒力菌株。经药敏试验发现，该菌株具有多重耐药性，包括氟苯尼考、氯霉素、四环素、阿米卡星、卡那霉素、链霉素、替米考星、红霉素、克林霉素、林可霉素和磺胺甲嗯唑等。为解析该强毒力菌株的多重耐药性，并为后续该强毒力菌株的研究提供资料，对该菌株进行了全基因组完成图测序分析。App6基因组全长2409072bp，平均GC含量为41.49％，与其他已报道的App菌株相似;共预测得到2265个可读框、61个tRNA和19个rRNA操纵子;未发现质粒DNA的存在。此外，在App6基因组中发现了SXT/R391类型的整合性接合元件，命名为ICEAplChn1，该元件包含8个可变插入区，包括VRⅡ、VRⅢ、HS1、HS2、HS3、HS4、HS5和一个新的插入区，命名为VRⅥ;ICEAplChn1携带了7个抗生素耐药基因tet(A)、erm(42)、floR、aphA6、strB（两个拷贝）、strA和sul2，这解释了该菌株的多重耐药性，同时ICEAplChn1的发现表明ICE元件是除了质粒以外，App中耐药基因的另一重要携带者。
　　细菌能否建立感染与致病取决于细菌和宿主的基因组及其基因的表达状态。In vivo RNA-seq可以相对真实、全面地反映细菌入侵机体过程中的基因表达与调控情况。为进一步探究App的毒力相关基因及其表达调控机制，研究以App6强毒力菌株为对象，首先建立了猪传染性胸膜肺炎的小鼠模型;进而以该菌株的基因组完成图为参考基因组，采用链特异性RNA-seq技术对体外培养和体内感染的细菌进行了转录组差异分析，筛选出471显著差异表达基因，这些显著差异表达基因一定程度反映了细菌在体内建立感染及发挥毒力作用的重要基因。这些差异基因中，上调差异基因316个，占App6基因组全部可读框(2295个，包括假定蛋白)的13.95％，它们囊括了该菌近年来最新研究的众多基因。此外，借助多种生物学软件，对471个差异基因进行分析预测得到了82个分泌性蛋白。相信这些差异表达基因及其分泌性蛋白的预测，将为深入研究App的致病机制及潜在的疫苗靶基因提供一定的参考依据。
　　前期实验证实，App6菌株在引起小鼠体内感染时，Sec分泌途径相关基因得到普遍上调表达，其中，secD、secF和yajC基因均位于同一个操纵子之上。研究首先构建该菌株的yajC基因缺失株，通过研究该缺失株的特性，从而揭示胸膜肺炎放线杆菌yajC基因的生物学功能。研究从yajC基因对生物被膜的形成、小鼠致病力以及小鼠肺脏的清除能力等方面进行了探讨，发现该基因的缺失不影响细菌的生长曲线，但导致生物被膜形成能力降低;yajC的缺失不影响细菌的毒力，但可加速包括致死剂量和可转归健康剂量的细菌在肺脏的清除速率;yajC的缺失不影响细菌对细胞的黏附，但降低了细菌入侵细胞的能力。关于yajC在细菌建立体内感染时发挥的具体作用以及对细菌的Sec分泌系统的贡献等方面还需进一步研究。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 胸膜肺炎放线杆菌

1．1．1 概述

1．1．2 胸膜肺炎放线杆菌的毒力因子

1．2 胸膜肺炎放线杆菌的基因组学研究概述

1．2．1 已发表的胸膜肺炎放线杆菌基因组

1．2．2 胸膜肺炎放线杆菌SXT／R391的发现

1．3 基于RNA-seq方法研究细菌的毒力相关基因及其表达调控

1．3．1 转录组学

1．3．2 RNA-seq技术

1．3．3 体内RNA-seq

1．4 革兰阴性菌的分泌系统

1．4．1 Ⅰ型～Ⅵ型分泌系统概述

1．4．2 一般分泌途径

1．4．3 双精氨酸分泌途径

1．4．4 总转位复合体SecYEG-SecDF-YajC-YidC

1．4．5 分泌蛋白与信号肽

1．5 研究目的和意义

第二章 胸膜肺炎放线杆菌App6株的基因组完成图及ICEAp／Chn1的鉴定与分析

2．2．1 材料

2．2．2 方法

2．3 实验结果

2．3．1 生长特性和血清型鉴定

2．3．2 耐药性测定

2．3．3 基因组DNA的质量分析

2．3．4 基因组完成图测序结果

2．3．5 SXT／R391元件的提取和结构分析

2．3．6 SXT／R391元件的系统进化分析

2．3．7 SXT／R391元件的环状中间体鉴定

2．3．8 SXT／R391元件的接合转移试验

2．4 讨论

第三章 胸膜肺炎放线杆菌App6株的体内转录组学研究

3．1 前言

3．2．1 材料

3．2．2 方法

3．3 实验结果

3．3．1 猪传染性胸膜肺炎小鼠模型的建立

3．3．2 RNA的质量控制

3．3．3 测序评估、差异基因筛选及功能分析

3．3．4 差异表达基因的qRT-PCR验证

3．3．5 差异表达基因的分泌蛋白预测

3．4 讨论

第四章 yajC基因缺失株的构建及生物学特性研究

4．1 前言

4．2 材料与方法

4．2．1 材料

4．2．2 方法

4．3 结果

4．3．1 缺失株的构建结果

4．3．2 缺失株的遗传稳定性、生长特性

4．3．3 缺失株侧翼基因表达水平鉴定

4．3．4 缺失株的生物被膜形成能力测定

4．3．5 缺失株的小鼠生存曲线

4．3．6 肺脏清除能力测定

4．3．7 小鼠细胞因子转录水平测定

4．3．8 细胞黏附和入侵的测定

4．4 讨论

第五章 全文结论

参考文献

附录

致谢

作者简介