胸膜肺炎放线杆菌relA基因缺失株的构建及其生物学特性的研究

摘要

胸膜肺炎放线杆菌(Actinocillus pleuropneumoniae,APP)是猪传染性胸膜肺炎的病原菌。该病以纤维性肺炎和出血性肺炎为主要病症，具有高发病率和死亡率，呈世界性流行，给全球养猪业造成严重的经济损失,对杂交野猪的饲养造成潜在威胁。严谨应答是细菌在应对环境压力和营养不足时，为生存快速感知和适应环境变化的调控反应。(p)ppGpp是细菌严谨反应的重要信号分子，主要由relA基因编码的合成酶RelA磷酸化GDP或GTP而合成。因此，本研究通过同源重组、卡那抗性及蔗糖负向筛选的方法，以本实验室保存的APP血清7型野生菌S8为亲本株，构建relA基因缺失株S8△relA，并对其生物学特性进行了初步研究，为进一步探究APP的适应性和致病机制奠定了一定的基础。
　　本研究主要内容包括：⑴构建缺失株S8△relA：根据GenBank中APP血清7型 S8株 relA基因序列(NC.009053.1)和pET28a质粒设计引物，分别扩增relA基因同源上下臂relAS、relAX及kan基因，再通过融合PCR将三个片段连接，并克隆至pEMOC2载体中，构建重组转移质粒 pEMOC2-relAS-kan-relAX。重组质粒电转至 E.coliβ2155获得的重组菌E.coli(pEMOC2-relAS-kan-relAX)作为供体菌，亲本株S8作为受体菌，通过接合转移的方法，筛选出具有卡那抗性(KanR)和氯霉素抗性(CmR)的单交换菌株。利用引物P7/P8鉴定正确后，挑取单菌落分别影印于含 Cm抗性平板和含10%蔗糖、Kan抗性平板上，筛选出具有蔗糖抗性、KanR和氯霉素敏感(CmS)的克隆，再利用P3/P4和P9/P10引物进行PCR鉴定，能够扩增出kan基因(816bp)片段，不能扩增出relA基因片段，即可确定该克隆为缺失株。⑵缺失株S8△relA生物学特性：将得到的缺失株S8△relA在体外连续传代培养，通过引物鉴定，结果表明该缺失株具有良好的遗传稳定性；生长曲线测定结果表明缺失株S8△relA与亲本株S8增殖速度变化差异不显著。在平台期营养限制环境下，24 h后S8△relA存活能力降低，说明缺失株的适应性下降。对20种不同氨基酸分别进行缺失，其中在Gly、Ile、Val营养缺失时，S8△rel增殖能力显著受到抑制，结果表明(p)ppGpp能够感知Gly、Ile、Val这三种氨基酸形成的外界压力信号。持留菌形成试验：100μg/mL氟苯尼考杀菌处理3 h后，与野生菌S8相比，缺失株S8△relA形成具有耐药表型的活菌比例显著下降，说明(p)ppGpp影响APP持留菌的形成。缺失株S8△relA生物被膜形成能力随培养时间延长，逐渐降低，并且36 h时生物被膜密度仅为野生菌S8的0.5倍；另外，体外抗肺泡巨噬细胞(PAM)吞噬能力也显著减低，试验结果显示与野生菌S8相比差异极显著。对小鼠致病性实验结果表明，基因缺失株S8△relA相比亲本株S8毒力降低2.7倍。

目录

1 绪论

1.1 胸膜肺炎放线杆菌概述

1.2 (p)ppGpp研究进展

1.3 研究目的和意义

2 材料与方法

2.1 试验材料

2.2 试验方法

3 结果

3.1 重组质粒pEMOC2-relAS-kan-relAX的构建

3.2 缺失株S8△relA筛选和鉴定

3.3 缺失株S8△relA的遗传稳定性

3.4 缺失株S8△relA体外增殖能力测定

3.5 平台期营养限制环境影响缺失株S8△relA存活能力试验

3.6 不同氨基酸影响缺失株S8△relA增殖特性试验

3.7 氟苯尼考影响缺失株S8△relA持留性试验

3.8 缺失株S8△relA生物被膜形成试验

3.9 PAM吞噬试验

3.10 缺失株S8△relA的LD50测定

4 讨论

4.1 缺失株S8△relA的构建

4.2 应对营养胁迫，APP的(p)ppGpp的作用

4.3 应对抗生素杀菌压力，APP的(p)ppGpp的作用

4.4 (p)ppGpp影响APP致病性

结论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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