胸膜肺炎放线杆菌potD2基因缺失株的构建及其生物学特性研究

摘要

胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae，APP)是一类引起猪传染性胸膜肺炎的病原微生物。potABCD多胺转运系统普遍存在于各类原核细菌，其中PotD属于一种底物结合蛋白，能特异性识别并结合多胺，参与多胺胞内转运;在一些细菌中potD基因突变，将诱导细菌一系列生理功能以及致病性的改变;APP基因组中也存在假定的多胺转运蛋白编码基因potD2，为探究该基因对APP某些生物特性及毒力的影响，本研究首先以眉山猪场感染猪群分离的Ⅰ型APP野毒株MS0721为母体，通过同源重组的原理构建potD2基因缺失株及其突变回复株，并探究突变株生物学特性的改变，主要内容如下:
　　1、MSΔpotD2缺失株及其互补株CΔpotD2的构建与鉴定
　　参考NCBI已公布的APP1型4074基因组序列，以亲本株MS0721基因组为模板，设计引物分别扩增目的基因potD2的上下游序列同源臂;经两步法重叠延伸PCR，将左右同源臂融合后与自杀性质粒pEMOC2定向连接，PCR、酶切及测序分析鉴定正确，成功构建重组自杀性质粒pEMOC2-ΔpotD2。将重组自杀性质粒pEMOC2-ΔpotD2转化到供体菌β2155感受态，利用亲本株滤膜杂交的方法与APP MS0721共同培养，质粒pEMOC2-ΔpotD2通过结合转移的方式导入受体APP，通过正向筛选出氯霉素抗性、蔗糖敏感菌落，并PCR鉴定为整合了重组质粒的一次单交换菌株。随机挑选上述一次重组菌落，经传代培养后负向筛选出对蔗糖不敏感、无氯霉素抗性的双交换重组菌落，最终PCR鉴定成功筛选出4株potD2基因缺失突变株。同理参考4074基因组序列，设计引物扩增potD2整个阅读表达框架，酶切后与穿梭质粒PLS88定向连接，构建穿梭互补质粒pLS88-potD2，PCR及酶切鉴定正确，插入目的基因测序分析无碱基突变。利用电转法将互补质粒pLS88-potD2导入APPMSΔpotD2缺失株感受，并涂布于卡那抗性的TSA培养基，进而获得具有卡那抗性APP菌落，最后通过PCR鉴定，成功获得互补株CΔpotD2。最后进行western blot鉴定结果显示，MS0721和互补株菌体变性蛋白中分离出目的蛋白条带约37KD，而MSΔpotD2突变株中无此目的条带，由此可见，potD2基因在突变株中不能表达，基因敲除成功，而在互补株中正常表达也说明互补株的成功构建。
　　2、MSΔpotD2生物学特性及其小鼠毒力试验研究
　　检测MSΔpotD2及互补株的稳定性表明MSΔpotD2和CΔpotD2传10代培养，每代均能正常生长繁殖，且potD2基因敲除后无回复突变，互补质粒也稳定存在。生长特性研究发现，MSΔpotD2缺失株在对数生长前期低于亲本株和互补株，然而几乎同时到达同一稳定平台期，这表明potD2基因的敲除仅对细菌生长活性无明显影响。菌液接种于含5％新鲜山羊血的TSA培养基，观察溶血情况表明三株菌株都具有完全溶血的活性，而MSΔpotD2溶血直径略低于MS0721及CΔpotD2。分别使用96孔培养法和试管培养法检测生物被膜的生成，结果发现三株菌株都不能形成生物膜，推测可能有细菌血清型有关。取对数生长期菌液MS0721、MSΔpotD2及CΔpotD2稀释后于含0.3M KCl和NaCl的TSA平板中过夜培养，通过存活率比较来评估potD2基因对细菌耐高渗透压的影响，结果发现MSΔpotD2在高渗的环境中存活率低于亲本株和突变回复株，差异明显。此外研究菌株的耐氧化和耐热特性发现，经0.8mM的H2O2处理后，MSΔpotD2存活率不到10％，远低于亲本株MS0721和CΔpotD2; MSΔpotD2热激后的存活率也明显低于MS0721和CΔpotD2，以上说明potD2基因缺失后影响了APP的环境压力耐受能力。小鼠攻毒实验测各菌株半数致死量LD50，结果表明MSΔpotD2缺失株毒力略低于亲本株和互补株，但是差异不显著，说明potD2基因缺失对APP毒力的影响很小。

目录

声明

摘要

缩略语表

综述

1 猪传染性胸膜肺炎概述

2 胸膜肺炎放线杆菌致病机理

3 细菌多胺及其代谢

3．1 多胺合成

3．2 多胺分解

4 多胺与细菌致病性研究

4．1 参与毒力蛋白的表达

4．2 增强细菌逃避机体免疫

4．3 影响细菌抗氧化胁迫和酸化胁迫

4．4 影响生物膜的形成

5 多胺转运蛋白PotD研究进展

5．1 多胺转运系统

5．2 多胺(亚精胺)结合蛋白PotD的研究

5．3 胸膜肺炎放线杆菌研究进展

研究目的意义

第一章 APP potD2基因缺失株及其互补株构建与鉴定

1 材料

1．1 实验菌株与质粒

1．2 主要试剂

1．3 培养基配置

1．4 主要仪器

1．5 引物设计

2 方法

2．1 胸膜肺炎放线杆菌基因组DNA的提取

2．2 potD2左右同源臂的扩增及融合

2．3 重组自杀性转移质粒pEMOC2-Δ potD2的构建

2．4 MS Δ potD2缺失株的构建

2．5 CΔpotD2互补株的构建

2．6 potD2免疫印迹检测

3 结果

3．1 potD2基因左右同源臂的扩增及融合

3．2 重组自杀性质粒的PCR、酶切及测序鉴定

3．3 缺失株的筛选与鉴定

3．4 互补穿梭质粒的鉴定分析

3．5 互补株筛选鉴定

3．6 western blot鉴定

4 讨论

4．1 关于缺失株的构建

4．2 关于互补株的构建

5．小结

第二章 MS Δ potD2缺失株及其互补株的生物学特性研究

1 材料

1．1 菌株

1．2 主要试剂

1．3 实验仪器与耗材

1．4 实验动物

2 方法

2．1 遗传稳定性试验

2．2 生长实验

2．3 溶血性实验

2．4 影响生物膜生成实

2．5 压力耐受性实验

2．6 小鼠致病性实验

3 结果

3．1 遗传稳定实验

3．2 生长曲线的测定

3．3 溶血活性结果

3．4 生物膜实验

3．5 压力耐受

3．6 LD50的测定

4 讨论

4．1 关于生长特性

4．2 关于生物膜的形成

4．3 关于抗环境压力胁迫

5 小结

结论

参考文献

致谢