重组牛凝乳酶原在毕赤酵母中高效表达策略

摘要

凝乳酶(chymosin，EC34234)是一种天冬氨酸蛋白酶，是干酪加工过程的关键性酶。凝乳酶传统上是从未断奶的小牛皱胃中提取，随着干酪产量增加，这种方法已不能满足当前市场的需求。基因工程菌株作为一种新的高效蛋白生产途径，有望解决牛凝乳酶来源短缺的难题。
　　本研究将牛来源凝乳酶原基因在巴斯德赤酵母系统中异源表达。通过密码子优化、融合标签蛋白表达、启动子选择和发酵条件优化的策略提高重组牛凝乳酶原在毕赤酵母中的表达量。
　　依据毕赤酵母的密码子偏好性，按照OptimumGeneTM算法对牛凝乳酶原基因pcw进行密码子优化得到pcm14基因。在pcm14基因前端融合标签蛋白基因cherrym得到clpcm14基因。pcm14和clpcm14基因在毕赤酵母中表达，分别筛选到产酶活力最高的菌株2-70和clp2-91。在摇瓶水平这两株菌中目的基因转录水平相近，基因拷贝数相同，凝乳酶活力分别为2188SU/mL和3705SU/mL。
　　在clpcm14基因表达盒的基础上，用组成型启动子PGAP替换甲醇诱导启动子PAox1，筛选得到高表达菌株GH-1。对GH-1菌株的发酵过程进行工艺优化，包括pH值、补料方式和碳源的优化。发酵最优条件是pH40，以葡萄糖为碳源，采取分批补料方式发酵。GH-1菌株生产凝乳酶活力最高可达到12000SU/mL，培养基中蛋白含量为028mg/mL。在3L发酵罐水平，组成型菌株GH-1的生产强度是诱导型菌株clp2-91的3倍。
　　本研究将多种可提高毕赤酵母菌株外源蛋白表达量的优化策略进行组合，筛选到的高产菌株GH-1能够高效生产牛凝乳酶原，其生产强度满足酶制剂生产企业需求，有很高的工业化大规模生产潜力。

目录

声明

摘要

第一章 引言

1．1 干酪的国内外发展现状

1．2．1 凝乳酶的结构和凝乳机理

1．2．2 凝乳酶的来源

1．2．3 重组凝乳酶在不同微生物表达系统中的研究

1．3 巴斯德毕赤酵母表达系统

1．4 提高毕赤酵母中外源蛋白表达量的策略

1．4．3 目的基因剂量对蛋白表达影响

1．4．5 发酵条件优化

1．5 研究目的和意义

第二章 密码子优化和融合蛋白对牛凝乳酶原表达量的影响

2．1 实验材料

2．1．4 工具酶

2．2．1 表达载体pPIC9-pcm14和pPIC9-clpcm14的构建

2．2．2 质粒pPIC9-pcm14和pPIC9-clpcm14转化Ecoli Trans1-T1感受态细胞

2．2．3 质粒pPIC9-pcm14和pPIC9-clpcm14在毕赤酵母GS115中的表达

2．2．5 摇瓶水平比较两种策略得到的高酶活菌株的表达情况

2．2．6 高酶活菌株转录水平分析和基因拷贝数测定

2．3 实验结果

2．3．2 表达载体pPIC9-pcm14和pPIC9-clpcm14的构建

2．3．3 重组质粒pPIC9-pcm14和pPIC9-clpcm14转化毕赤酵母GS115

2．3．4 pPIC9-pcm14和pPIC9-clpcm14重组毕赤酵母阳性菌株筛选

2．3．5 比较两种策略得到的最高酶活菌株的表达情况

2．3．6 不同策略得到的高酶活菌株转录水平和基因拷贝数分析

2．4 讨论

第三章 启动子的选择对毕赤酵母分泌牛凝乳酶原的影响

3．1 实验材料

3．2 实验方法

3．2．4 组成型重组酵母菌株酶活表达检测

3．3 实验结果

3．3．2 毕赤酵母GS115-H的构建

3．3．3 质粒pGAPZα-clpcm14在毕赤酵母GS115-H中的表达

3．3．4 组成型重组牛凝乳酶原阳性菌株的筛选

3．4 讨论

第四章 毕赤酵母重组菌株的发酵培养及发酵条件的优化

4．1 材料

4．2．2 组成型菌株GH-1的发酵条件的优化

4．2．3 组成型菌株GH-1的发酵过程中蛋白表达检测

4．3 结果

4．3．2 组成型GH-1重组酵母菌株发酵条件优化

4．3．3 组成型菌株GH-1发酵过程蛋白检测

4．4 讨论

第五章 全文结论

参考文献

致谢

作者简历