重组乙肝表面抗原在毕赤酵母中的表达纯化及其高密度发酵的研究

摘要

本论文开展重组HBsAg的体外表达、表达后纯化及其发酵罐高密度发酵的研究。 从已确诊的乙肝病人血清中提取DNA,利用Primer 5.0,参照GeneBank发表的序列,设计针对编码HBsAg S基因的特异性引物。PCR扩增S基因,将其分别克隆入毕赤酵母胞内表达载体pPICZA中,成功构建了重组质粒pPICZA-S和pPICZA-SH。构建的重组子经Sac Ⅰ线性化后,LiCl化学法转化入酵母菌株GS 115、X-33、KM71H和SMD1168。利用抗生素Zeocin筛选重组子,诱导表达后,进行SDS-PAGE和ELISA鉴定。结果表明,HBsAg在毕赤酵母中得到胞内表达,未得到分泌表达。然后,进行westem-blotting分析,结果表明目的蛋白能与抗-HBs单克隆抗体发生特异性反应。重组酵母工程菌扩大培养后,筛选表达量高的工程菌株,并确定最佳的诱导表达时间。结果显示,GS115工程菌诱导表达后单位体积的培养基所得的抗原含量最高,根据ELISA检测HBsAg的标准曲线,粗略估算表达量为15.3 mg/L,最佳收获时间为72 h。pPICZA-SH和pPICZA-S表达蛋白分别经Ni-NTA亲和层析和PEG结合层析方法纯化,得到较纯的HBsAg,其免疫原性与抗原活性良好,能够成为工业化生产的优良菌株。筛选的GS115工程菌进行高密度中试发酵的研究,结果表明,发酵96 h为最佳收获时间,表达量达到65.3 mg/L。

目录

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第一章绪论

1.1乙型肝炎概述

1.2HBV的形态、结构、抗原组成

1.2.1 HBV的发现和命名

1.2.2 HBV的生物学特性

1.3 HBV基因型与血清型

1.3.1 HBV基因型的发现

1.3.2 HBV基因型和血清型的关系及流行病学分布

1.4乙肝表面抗原、抗体的检测意义

1.4.1检测乙肝表面抗原抗体的意义

1.4.2检测乙肝表面抗原抗体的用途

1.5基因工程乙肝表面抗原的制备

1.5.1大肠杆菌表达系统

1.5.2酵母表达系统

1.5.3哺乳动物细胞表达系统

1.5.4病毒表达系统

1.5.5植物表达系统

1.6立题背景及意义

第二章乙肝表面抗原在毕赤酵母中的表达

2.1材料

2.1.1菌株和表达载体

2.1.2材料和试剂

2.1.3仪器和设备

2.2实验方法

2.2.1病毒DNA模板的获取

2.2.2引物设计与合成

2.2.3 PCR扩增HBsAg基因

2.2.4 Ecoli感受态细胞的制备

2.2.5真核表达载体的构建

2.2.6 LiCL方法制备酵母感受态细胞及其转化

2.2.7重组酵母菌表型的筛选

2.2.8重组酵母菌的鉴定

2.2.9目的蛋白ELISA检测

2.2.10酪蛋氨基酸对目的蛋白表达的影响

2.3.结果与讨论

2.3.1目的基因的获得及其克隆载体酶切

2.3.2目的基因的测序

2.3.3酵母表达载体的酶切鉴定

2.3.4酵母诱导表达及其SDS-PAGE分析

2.3.5表达蛋白Western blotting分析

2.3.6 ELISA分析表达结果

2.3.7酪蛋氨基酸对目的蛋白表达的影响

2.4本章小结

第三章重组乙肝表面抗原的纯化

3.1材料

3.1.1菌株

3.1.2常用材料与试剂

3.1.3主要试剂配方

3.1.4仪器和设备

3.2实验方法

3.2.1菌种的确定

3.2.2 GS115-pPICZA最佳收获时间的确定

3.2.3 GS115-pPICZA大量诱导表达

3.2.4酵母细胞裂解方式的选择

3.2.5 Ni-NTA亲和层析纯化pPICZA-SH

3.2.6 PEG沉淀结合层析纯化pPICZA-S

3.3结果与讨论

3.3.1最佳收获时间的确定

3.3.2表达量的粗略估算

3.3.3 SDS.PAGE分析Ni-NTA纯化的目的蛋白

3.3.4 PEG结合层析纯化的目的蛋白

3.4本章小结

第四章重组乙肝表面抗原高密度发酵的研究

4.1材料和设备

4.1.1菌种

4.1.2发酵培养基配方

4.1.3设备

4.2实验方法

4.2.1培养

4.2.2测定分析方法

4.3结果与分析

4.3.1酵母工程菌的高密度发酵

4.3.2甲醇流加速度对对乙肝表面抗原表达的影响

4.3.3不同甲醇流加方式对重组毕赤酵母表达表面抗原的影响

4.4本章小结

结论和展望

参考文献

攻读学位期间取得的研究成果

致 谢