基因改造牛凝乳酶基因在毕赤酵母中的表达

摘要

目的:构建小牛凝乳酶毕赤酵母分泌型表达载体,表达重组凝乳酶.方法:通过转换工具将小牛凝乳酶基因的氨基酸密码子转换成酵母偏好密码子,而后用全基因合成的方法获得小牛凝乳酶原的基因片段,将目的基因插入酵母表达载体pPIC9K结合因子分泌信号下游,得到重组载体.线性化后电转化毕赤酵母GS115,筛选并PCR鉴定重组酵母菌.阳性转化子经摇瓶表达,取上清沉淀后做SDS-PAGE分析并检测凝乳酶的活力,通过检测阳性转化子产凝乳酶的活力.结果:经测序及PCR证实,具酵母偏好密码子的凝乳酶基因准确插入酵母表达载体pPIC9K中,转化后重组载体通过同源重组整合进入酵母基因组中.SDS-PAGE分析证明凝乳酶的分子量约为35kD,测得培养基中凝乳酶的酶活为7.6SU/ml.结论:成功构建出酵母表达载体pPIC9K-rennin,在培养基中获得分泌表达的有活性的重组凝乳酶.