利用CRISPR/Cas9技术编辑粒长基因GS3改善粳稻开花时间

摘要

水稻是世界主要的粮食作物之一，我国水稻的种植面积约3067hm2，其中粳稻种植面积约占21.7％，而杂交粳稻的种植面积仅占粳稻播种面积的5％，相比杂交籼稻而言，杂交粳稻的发展相对缓慢，应用十分有限，其中制种产量低是影响杂交粳稻发展的主要因素之一，而粳稻开花习性差是制约制种产量的主要因素，主要表现在开花不集中且分散，高峰期不明显。
　　近年来，随着育种工作者对杂交水稻亲本开花习性的研究发现，同一亚种（籼稻或粳稻）水稻，其开花习性也存在差异。谷粒越长，开花越早，谷粒越圆，开花越迟，而这在粳稻品种中尤为突出。由于谷粒长度和长宽比具有稳定的遗传特性，因此粒型可作为现今选育早花时不育系的一种参考，可望通过改变谷粒的长度和长宽比来调整水稻开花早晚的问题。
　　本研究利用CRISPR/Cas9技术对调控粒型基因GS3定向编辑，以13个常规粳稻为背景进行转基因试验，获得13对近等基因系材料。主要研究如下:
　　1.靶位点敲除的构建
　　GS3基因位于水稻第三号染色体上，含有5个外显子，编码一个由232个氨基酸组成的跨膜蛋白，而该基因所编码的蛋白对粒型起负调控作用，根据CRISPR/Cas9系统识别前间区序列临近基序的特异性，在第一外显子上起始密码子(ATG)处上下游8bp左右设计gRNA靶位点。
　　2.农杆菌转化及转基因植株T0代获得
　　将构建好的靶位点PC1300-Cas9-GS3载体通过热激转化到农杆菌EHA105内，然后分别转化水稻材料长白25、吉粳102、空育131、垦鉴稻6号、浙粳22、浙粳88、武运粳27、扬粳4227、南粳9108、J5933、J6167、J5938、J42的愈伤组织。然后提取T0植株的DNA，进行PCR酶切试验并通过测序验证。
　　3.农艺性状考察
　　我们对转基因后代的播始历期、株高、粒长、粒宽及长宽比等农艺性状进行田间调查，分析结果表明。13份转基因植株在粒长和长宽比上出显著增加，播始历期和粒宽无显著差异，大部分转基因系株高显著降低。
　　4.开花时间差异分析
　　选取同一背景条件下的13对材料，对纯和突变的后代植株进行田间花时调查分析，结果表明突变体的花时早于野生型花时，且吉粳102、武运粳27、空育131、浙粳88和扬粳4227的gs3突变体开花时间均显著早于野生型，其余材料开花也提前但不显著。
　　利用CRISPR/Cas9技术成功对GS3基因进行编辑来改善粳稻开花习性，这一研究可为粳稻粒型育种提供参考，加速长粒粳稻亲本选育，有望推动杂交粳稻发展。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 水稻颖花开放机理

1．1．1 水稻的颖花

1．1．2 水稻的开花过程

1．1．3 水稻开花的诱导因子

1．1．4 水稻开花调查方法

1．2 基因编辑技术研究进展

1．2．1 锌指核酸酶(ZFN)

1．2．2 转录激活因子核酸酶(TALEN)

1．2．3 CRISPR／Cas9系统

1．3 本实验的目的及意义

第二章 探究粳稻粒型对开花时间的影响研究

2．1 实验材料与试剂

2．1．1 实验材料

2．1．2 菌株和质粒载体

2．1．3 实验试剂和仪器

2．1．4 常用试剂配制

2．2 实验方法

2．2．1 靶位点的选择及验证

2．2．2 中间载体SK-gRNA的构建

2．2．3 表达载体PCI300-Cas9的构建

2．2．4 水稻遗传转化

2．2．5 水稻DNA的提取

2．2．6 转基因阳性株的获得及检测

2．2．7 突变类型分析

2．2．8 突变体表型分析

2．2．9 开花时间调查

第三章 结果与分析

3．1 CRISPR／Cas9表达载体的验证

3．2 获取转基因阳性植株

3．3 基因型检测分析

3．4 突变体农艺性状考察分析

3．5 开花时间差异分析

4．1 讨论

4．2 结论

参考文献

附录

致谢

作者简历