稳定支持小反刍兽疫病毒增殖的永生化羊源细胞系构建及鉴定

摘要

小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus，PPRV)作为副黏病毒科麻疹病毒属的一个重要组成成员，在临床上能够引起野生和家养小反刍动物发病，以高热，肺炎，腹泻和呼吸道黏膜炎症为主要特征。PPRV属于有囊膜的单股负链RNA病毒，基因组大小为15948nt，编码8个蛋白（N、P、C、V、M、F、HN和L）。
　　动物细胞系是病毒基础研究和应用的主要平台之一。然而，有许多病毒因缺乏能支持其稳定增殖的细胞系，例如PPRV和RHDV等。而导致其相关基础和应用研究工作进展十分缓慢。为解决该技术瓶颈，原代细胞的永生化技术应运而生。
　　本研究旨在构建一株能稳定支持PPRV增殖的羊源永生化细胞系。首先，构建了pLOV-puro-hTERT重组质粒，然后利用慢病毒包装系统，从293T细胞中拯救出重组慢病毒并感染原代绵羊肺成纤维细胞，在感染48h后，用嘌呤霉素连续加压,筛选出具有抗性的存活细胞，将其扩增并连续传代至第10代，分别用分子生物学和年医学方法鉴定以后，最终获得了永生化原代绵羊肺成纤维细胞系，并将其命名为SLT细胞系。遗憾的是，RT-PCR和WB结果显示SLT细胞系可以支持PPRV的增殖，但是并没有出现PPRV典型的细胞病变并且PPRV在SLT细胞上传至第五代后也检测不到PPRV的存在，同时表明SLT细胞系不能稳定支持PPRV的增殖。
　　有研究表明山羊信号淋巴激活分子（Goat Signaling Lymphocyte Activation Molecule，gSLAM）是PPRV感染易感宿主细胞的一个重要的细胞受体之一。为了增加永生化细胞系（SLT细胞）对PPRV的敏感性，我们利用慢病毒包装系统又构建了稳能定表达gSLAM的绵羊肺成纤维细胞系，命名为SLT-gSLAM细胞系。同时本研究制备了具有良好特异性的鼠抗gSLAM蛋白多克隆抗体，为SLT-gSLAM细胞系的鉴定工作提供了良好的基础鉴定材。PPRV-Nigeria/75株接种SLT-gSLAM细胞并连续传代3次后，发现细胞产生典型的合胞体现象，并且可连续传至10代。RT-PCR和WB方法的检测结果均显示:SLT-gSLAM细胞系可以稳定地支持PPRV的增殖，并且病毒在感染细胞后48h，滴度可以达到1056TCID50/mL。
　　综上所述，本研究成功构建了一株可以稳定支持PPRV体外增殖的羊源细胞系，为深入研究PPRV的分子致病机制提供了一个良好的操作平台。

目录

声明

摘要

第一章 引言

1．1 小反刍兽疫及其病原

1．2 PPR的流行病学

1．3 PPR临床症状和组织病理学

1．4 PPRV的基因组结构及蛋白功能

1．5 PPRV的复制周期

1．5 PPRV疫苗

1．6 小结

1．7 研究目的及意义

第二章 永生化绵羊肺细胞系的构建及应用

2．1 材料与方法

2．1．1 材料和试剂

2．1．3 制备重组慢病毒

2．1．4 原代绵羊肺成纤维细胞的制备

2．1．5 最佳嘌呤霉素筛选浓度确定

2．1．6 RT-PCR鉴定重组慢病毒中hTERT基因

2．1．7 重组慢病毒感染原代绵羊肺成纤维细胞

2．1．8 基因组水平以及转录水平检测hTERT基因

2．1．9 Western blot检测SLT细胞中hTERT基因

2．2 病毒敏感性实验

2．2．1 病毒蛋白检测

2．3 结果

2．3．1 酶切鉴定重组质粒

2．3．2 RT-PCR检测重组慢病毒中hTERT基因

2．3．3 永生化绵羊肺成纤维细胞的形态

2．3．4 PCR及RT-PCR检测SLT细胞中的hTERT基因

2．3．5 Western blot鉴定hTERT基因

2．3．6 SLT细胞对PPRV-N75株的敏感性检测

2．3．7 SLT细胞中病毒基因的表达鉴定

2．4 讨论

第三章 gSLAM基因的克隆、原核表达及多克隆抗体制备

3．1 材料与方法

3．1．1 菌株与质粒

3．1．2 主要试剂

3．1．3 gSLAM基因的克隆

3．1．4 重组原核表达载体的构建与鉴定

3．1．5 重组质粒的原核表达

3．1．6 gSLAM蛋白的粗纯化

3．1．7 gSLAM蛋白多克隆抗体的制备

3．1．8 多克隆抗体的特异性检测

3．2 结果与分析

3．2．1 gSLAM基因的克隆

3．2．2 重组表达质粒的鉴定

3．2．3 gSLAM蛋白鉴定及可溶性分析

3．2．4 gSLAM蛋白多克隆抗体的WB和IFA分析

3．3 讨论

第四章 稳定表达山羊SLAM基因细胞系的构建与鉴定

4．1 材料与方法

4．1．1 材料和试剂

4．1．2 重组慢病毒载体(pLOV-eGFP-gSLAM)的构建

4．1．3 制备重组慢病毒

4．1．4 重组慢病毒感染SLT细胞

4．1．5 RT-PCR鉴定gSLAM基因

4．1．6 WB鉴定SLT-gSLAM细胞中gSLAM基因的表达

4．2 病毒敏感性实验

4．2．3 TCID50测定值病毒滴度

4．2．4 IFA检测SLT-gSLAM细胞中PPRV-N蛋白的表达

4．3 结果

4．3．1 重组质粒酶切鉴定

4．3．2 慢病毒感染永生化绵羊肺细胞系

4．3．3 PCR及RT-PCR鉴定SLT-gSLAM细胞中的gSLAM基因

4．3．4 WB鉴定SLT-gSLAM细胞中gSLAM基因的表达

4．3．5 病毒敏感性检测

4．3．6 SLT-gSLAM细胞中PPRV-N基因的表达鉴定

4．4 讨论

第五章 全文结论

参考文献

致谢

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