猪源和羊源沙门菌的分离鉴定及延迟减毒疫苗载体的构建

摘要

沙门菌是最常见的食源性致病菌之一，其危害范围极大，能够引起各类农产品的污染。目前，沙门菌所造成的食品污染是国际上极为关注的食品安全问题，据估计，美国每年由于沙门菌属细菌感染的病例约为140万[1]，在中国细菌性食物中毒中有70％～80％是由食入沙门菌而引起，研究其在食品动物中的污染及分布现状具有重要的公共卫生意义。本研究对江苏省某生猪屠宰场猪源病料，羊屠宰场以及部分猪场送检样品的沙门菌进行了分离鉴定，通过药敏试验和耐药基因检测，初步掌握了所分离的沙门菌耐药表型，分离菌株耐药表型与其所携带耐药基因之间的关系。研究结果有利于指导生产实践中抗菌药物的合理应用，同时也能为沙门茵引起的公共卫生安全和农产品安全问题的研究提供基础。
　　沙门菌作为一种侵袭性胞内菌，经减毒后具备强大的侵袭潜力，在宿主体内缓慢生长，能够有效、持续地刺激机体产生强有力的细胞、体液以及局部黏膜免疫应答。本论文在分离株中筛选出1株鼠伤寒沙门菌强毒株rSC0032;在其中分别引入ΔPcrp∷TT araC PBADcrp，ΔsopB及Δpmi突变，构建成延迟减毒的重组沙门菌，命名为rSC0117;以BALB/c小鼠为实验动物，评价了减毒的重组鼠伤寒沙门菌rSC0117的减毒效率。
　　1、猪源和羊源沙门菌的分离鉴定
　　为了解江苏省猪源沙门菌的污染情况，本文对2016年10月～2017年10月江苏省某生猪屠宰场猪源以及部分送检样品进行了增菌纯化，PCR鉴定，血清型鉴定以及16S rRNA聚类分析。结果从屠宰场459份随机采集的样品中共分离到80株沙门菌，其中35株为德尔卑沙门菌，16株为里森沙门菌，11株为纽兰沙门菌，9株为鼠伤寒沙门菌，3株为新斯托夫沙门菌，3株为恩昌加沙门菌，2株为彻斯特沙门菌，1株无法确定;其中230份肠道样品中分离到64株沙门菌，检出率达27.83％;肝脏及粪便样品检出率分别为8.43％(14/144)、3.17％(2/63);羊屠宰场以及部分猪场送检病料样品中则分离到2株鼠伤寒沙门菌以及4株猪霍乱沙门菌。本研究共计分离获得86株沙门菌。
　　基于沙门菌16S rRNA基因序列，将32种血清型共计129株沙门菌的16S rRNA基因序列通过系统发育进化树分析，所有菌株分为了3个分支，同时同一种血清型可分在不同簇中，同一分支内沙门菌16S rRNA基因同源性在99.6％～100％，遗传距离在0～0.002之间;所有菌株最大遗传距离为0.003，不同分支的所有菌株16S rRNA基因同源性在98.8％～100％。由此可以表明，16S rRNA基因序列不适合确定沙门菌血清型或推断同一属中细菌之间的系统发育关系。
　　2、沙门菌分离株的耐药性、耐药基因及毒力基因分析
　　运用K-B纸片扩散法对86株沙门菌分离株进行了22种抗菌药物的药敏试验。结果显示，所有分离株对四环素的耐药率最高，为76.74％，其次对氨苄西林、复方新诺明、磺胺异噁唑以及氯霉素的耐药率较高;对多粘菌素B(36.05％)等药物虽未产生耐药性，却具有相当高的中介率;对头孢西丁及丁胺卡那则完全敏感。86株沙门菌分离株中有9株非耐药分离株，其余耐药菌株中有57株沙门菌具有多重耐药性，以四重及五重耐药为多，分别占总数的19.77％与17.44％。对22对目标耐药基因的检测中，分离株共检出19种耐药基因，其中tetA基因检出阳性率最高，达60.74％，与分离株的耐药特性较为吻合;其次为catA1和aadA1，检出率分别为45.35％以及39.53％;未检测到qnrA、qnrC及qnrD基因，86株分离株中有12株未检测到耐药基因。
　　毒力基因检测中，有15株分离株未检出毒力基因，其余71株则至少携带mogA基因，携带率达82.56％，其中仅有3株菌株同时携带mogA，spvB及spvC毒力基因，且均为鼠伤寒沙门菌，阳性率为3.49％;另有4株猪霍乱沙门菌同时携带mogA及spvC基因，分离自发病猪源样品。总之，屠宰猪中沙门菌污染严重，且普遍存在多重耐药的现象，甚至其中一小部分携带有spv毒力质粒，对食品消费者来说是极大的安全隐患。因此，从源头控制好沙门菌的污染极为重要，应采取严格的卫生管理方法和HACCP体系，以减少交叉污染。
　　3、延迟减毒鼠沙门菌疫苗载体的构建及其生物学特性的研究
　　为了筛选免疫原性强且宿主范围广的沙门菌菌株作为减毒疫苗载体，本部分内容对7株鼠伤寒沙门菌分离株的毒力进行了测定。结果表明，7株鼠伤寒分离株对小鼠均有致病性，致死时间及剂量有所差异，其中4株分离株致病性较弱，其LD50介于103～104CFU之间，其余3株致病性较强，其LD50约为100CFU，这表明所检测的屠宰猪中不仅沙门菌污染严重，并且少部分分离菌株具有较强的致病能力。3株强致病性鼠伤寒沙门菌中有2株为猪源，1株为羊源，最终选取1株猪源鼠伤寒沙门菌rSC0032作为减毒疫苗载体。此外根据7株鼠伤寒携带的毒力基因检测结果，可以发现毒力质粒spvB及spvC与其致病性极有可能具有密切的相关性，可使菌株毒力极大增强。
　　筛选出候选株后，以鼠伤寒沙门菌强毒株rSC0032作为受体菌，以含自杀质粒的x7213为供体菌，运用自杀载体介导的同源重组技术，在鼠伤寒沙门菌强毒株rSC0032上分别引入能降低宿主炎性反应和提高免疫原性的ΔsopB突变，由阿拉伯糖调控延迟减毒的ΔPcrp∷TT araC PBAD crp突变，由甘露糖调控延迟减毒的Δpmi突变，最后获得rSC0032(ΔPcrp∷TT araC PBAD crp，ΔsopB,Δpmi)减毒株，命名为rSC0117;随后，检测了减毒株在BALB/c小鼠中的定居能力。结果表明，随着时间的增长，减毒菌株在各脏器上的菌量逐渐减少;接种减毒株第3d时，减毒株在肝脾中的菌量显著低于野毒株(P＜0.001)，表明其毒力显著下降，且在派耶尔氏淋巴结中的定植能力较强，较大可能保留了优良的免疫原性;在接种减毒株第7d时，rSC0117在派耶尔氏淋巴结中的菌量仅略有下降，表明减毒菌能够安全有效地诱导机体免疫应答反应。

目录

摘要

文献综述

1 沙门菌研究现状

1．1 沙门菌生物学特性

1．2 沙门菌致病机制

1．3 沙门菌耐药性研究

1．4 沙门菌耐药基因研究

1．5 沙门菌的毒力质粒

2 以沙门菌为活载体研究概况

符号说明

质粒说明

第一章 猪源和羊源沙门菌的分离鉴定

1 材料

1．1 被检病料

1．2 质控菌株

1．3 主要试剂

1．4 主要仪器

1．5 主要试剂的配制

2 方法

2．1 细菌的增菌、分离与纯化

2．2 革兰氏染色镜检

2．3 双重PCR方法鉴定沙门菌属细菌

2．4 血清型鉴定

2．5 16S rRNA序列分析

3．1 分离菌的菌落特征及染色镜检

3．2 PCR鉴定沙门菌属

3．3 血清型分布

3．4 沙门菌分离株16S rRNA测序结果及系统进化树分析

4 讨论

第二章 沙门菌分离株的耐药性、耐药基因及毒力基因分析

1 材料

1．1 菌株

1．2 主要试剂

1．3 药敏纸片

1．4 主要仪器

1．5 试剂配置

2．2 药敏试验

2．3 沙门菌耐药基因检测

2．4 毒力基因检测

3 结果

3．1 药敏试验结果

3．2 耐药基因检测结果

3．3 耐药表型与耐药基因的相关性

3．4 毒力基因

4 讨论

第三章 延迟减毒鼠伤寒沙门菌的构建及其生物学特性的研究

1 材料

1．1 菌株和质粒

1．2 实验动物

1．3 主要试剂

1．4 主要仪器

1．5 常用试剂的配制

2 方法

2．1 鼠伤寒沙门菌半数致死量(LD50)的测定

2．2 延迟减毒鼠伤寒沙门菌rSC0117(rSC0032△Pcrp∷TT araC PBAD crp，△sopB，△pmi)的构建

2．3 rSC0117(rsc0032△Pcrp∷TT araC PBAD crp，△sopB，△pmi)的定居实验

3 结果

3．1 半数致死量(LD50)测定结果

3．2 减毒鼠伤寒沙门菌rSC0032(△Pcrp∷TT araC PBAD crp，△sopB，△pmi)的构建

3．3 rSC0032、rSC0117在BALB／c小鼠体内的定居能力的测定结果

4 讨论

全文小结

参考文献

致谢

声明