Nbnrp1蛋白介导大丽轮枝菌激发子PevD1诱导本生烟抗病性的分子机制

摘要

PevD1是作者实验室从大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）XII8菌株发酵液中分离获得的蛋白激发子。Nbnrp1是前期筛选出的PevD1在本生烟中的互作蛋白，利用RNAi技术获得了Nbnrp1-RNAi转基因本生烟植株，初步证明Nbnrp1能调控PevD1诱导的细胞坏死和抗病性。本文在前期的基础上，进一步明确了Nbnrp1在PevD1诱导本生烟产生抗病性中的作用，并通过转录组测序的方法，对本生烟野生型(WT)和Nbnrp1沉默株系（Nbnrp1-RNAi）在PevD1诱导前后的差异表达基因进行筛选及功能分析，阐述了Nbnrp1调控PevD1诱导本生烟抗病性的分子机制，主要研究结果如下: 1.建立了PevD1的真核表达体系，获得了纯化的真核表达蛋白 构建了PevD1的真核表达载体pPICZαA-PevD1，并通过电转的方法将表达载体转入毕赤酵母感受态中;经博莱霉素Zeocin抗性筛选，获得阳性转化子并进行PevD1蛋白的诱导表达和纯化;通过SDS-PAGE和Western blot技术验证了融合蛋白的正确性;纯化的PevD1蛋白能够诱导本生烟叶片产生细胞坏死（HR反应），与天然蛋白的生物学活性一致。 2.Nbnrp1正调控PevD1诱导本生烟产生的防御反应和系统抗性 用10μM的PevD1蛋白液分别渗入野生型和Nbnrp1-RNAi株系的本生烟叶片，并分别取样检测H2O2的积累、胼胝质的沉淀以及MAPK磷酸化激活等早期防御反应;同时，比较PevD1诱导前后WT和Nbnrp1-RNAi两个株系产生系统抗性的差异。结果发现，相比于野生型，Nbnrp1-RNAi株系受PevD1诱导后在早期防御反应以及对大丽轮枝菌和TMV的系统抗性上都明显减弱，说明Nbnrp1正调控PevD1诱导的免疫反应。 3.转录组差异表达基因分析及qPCR验证 用10μM的PevD1蛋白液渗入本生烟叶片，分别在0h、6h、12h、24h和36h进行局部叶片取样。通过转录组测序技术分析了WT和Nbnrp1-RNAi两个株系受PevD1诱导前后在基因转录的差异，并对筛选到的差异表达基因进行GO功能注释和KEGG通路富集分析，结果发现差异表达基因主要富集在萜类次生代谢产物的合成途径。进一步从差异表达基因中挑选出10个抗病相关的基因进行了qPCR验证，其结果与转录组数据相符，说明了测序数据的准确性。 4.倍半萜类次生代谢产物合成途径参与了Nbnrp1介导的PevD1诱导的抗病性 倍半萜类次生代谢产物是本生烟植保素的重要组成成分，对富集在倍半萜类次生代谢产物合成通路中的差异表达基因进行比对分析，选出了6个关键基因进行表达量的qPCR验证。结果表明，经PevD1处理后，这些基因的表达水平在Nbnrp1-RNAi株系要显著低于野生型或表达水平呈现出整体滞后诱导的趋势。说明Nbnrp1基因的沉默抑制了倍半萜类次生代谢产物合成途径中关键基因的表达，进而影响了植保素的合成;倍半萜类次生代谢产物合成途径参与了Nbnrp1介导的PevD1诱导本生烟的抗病性。