蜂粮菌群分析、乳酸菌和酵母菌的筛选鉴定及应用

摘要

蜂花粉是蜜蜂从显花蜜粉源植物的花药内采集的花粉粒，加上蜜蜂自身的分泌物并由蜜蜂后肢上的花粉筐携带回巢的团状物。蜜蜂将蜂花粉、蜂蜜、蜜蜂分泌物等充分混合后，经特定微生物充分发酵后，贮存于巢房中供蜜蜂食用的物质即为蜂粮。本研究旨在对蜂粮中的细菌群落进行鉴定分析，找到蜂粮中的优势细菌。进一步从蜂粮中筛选出具有优良发酵性能的乳酸菌和酵母菌，并将其应用于蜂花粉的发酵，以改善蜂花粉的口感，提高人体或蜜蜂对蜂花粉的消化吸收。 首先，通过对卡尼鄂拉蜂（Apis mellifera carnica）发酵0.5d、4d、7d、12d的蜂粮样品以及卡尼鄂拉蜂(Apis mellifera carnica)、喀尔巴阡蜂(Apis mellifera carpatica Foti)、高加索蜂(Apis mellifera caucasica Gorb)发酵4d的样品采用高通量测序技术，分析不同发酵周期和不同种类西方蜜蜂的蜂粮微生物的16S rDNA序列，比较各组菌群的物种组成和丰度信息，通过Alpha多样性分析和蜂粮菌群多样性分析，考察了不同发酵时间对蜂粮发酵过程中菌落结构影响。对于不同发酵周期的蜂粮:4个样品中共鉴定出27个门、112个属的细菌，其中四个样品中有25个共有菌属。研究结果表明:此研究的测序深度有效地覆盖了其微生物种类，随着发酵时间的延长，蜂粮微生物群落的物种丰富度和多样性先升高后降低。基于门水平，Oxyphotobacteria和Proteobacteria为优势菌群。基于属水平，蜂粮优势微生物为unidentified Oxyphotobacteria，随着发酵的进行，unidentified Oxyphotobacteria受到抑制，发酵中期减少，发酵后期又增加，但unidentified Oxyphotobacteria始终是优势菌。对于不同种类西方蜜蜂的蜂粮:总体来看，不同种类西方蜜蜂的蜂粮的微生物群落之间无显著差异。 其次，以蜂粮为原料，分别利用MRS培养基和YPD培养基培养后，稀释涂布MRS和YPD平板进行乳酸菌和酵母菌的筛选。首先从蜂粮中分离出17株乳酸菌的疑似菌和5株酵母菌的疑似菌。筛选得到6株高发酵性能的乳酸菌和1株高发酵性能的酵母菌，并对7株菌株提取基因组DNA进行测序和比对，经鉴定为:Lactobacillus kunkeei和Saccharomyces cerevisiae菌株。并测定了两株菌的最适生长温度、pH、生长曲线和pH值变化曲线。 最后，将所筛得的乳酸菌和酵母菌应用于蜂花粉的发酵中，分别进行单菌、混菌的液态发酵和固态发酵。实验结果表明:(1)固态发酵后，蜂花粉的葡萄糖含量下降，总酚和总黄酮含量提高。接种混菌的灭菌花粉总酚和总黄酮含量增加最多，分别为25.3％、7.2％;接种混菌的未灭菌花粉发酵五周以后总酚和总黄酮含量最高，分别为11.65mg/g、23.24mg/g。(2)按固液比1∶2的比例对蜂花粉进行液态发酵后，葡萄糖含量总体呈下降趋势，但发酵初期略有增加，可能是菌群对糖类物质的分解;发酵后期葡萄糖含量亦有小幅度增加，可能是因为微生物代谢活动破坏了花粉细胞壁，造成细胞内容物溶出的结果。同时，总酚和总黄酮含量均有明显提高。