马NLRP3激活系统的建立及其在EIAV感染调控炎症反应研究中的初步应用

摘要

作为慢病毒家族中基因组结构最为简单的病毒，马传染性贫血病毒(EIAV)弱毒疫苗的研制成功可为包括人类免疫缺陷病毒(HIV-1)在内的其他慢病毒的致病与免疫保护机制研究提供重要参考。EIAV强毒感染马后临床上以贫血及多脏器的炎性坏死为特征。而疫苗株免疫马后并不引起器官的炎性损伤，安全有效。这些现象一方面表明，EIAV强毒株可以诱导炎症的过度激活;另一方面也表明EIAV强弱毒株在诱导及调控炎症方面具有差异性。 炎症小体的激活是炎症发生的核心。初期研究发现，EIAV强毒感染机体后能更有效地诱导炎症小体NLRP3mRNA的上调表达，同时强毒株感染后其下游的效应分子IL-18和IL-1β也较弱毒株有明显的优势表达。但对于EIAV病毒感染后是否激活NLRP3炎症小体以及激活的调控机制尚不清楚，马源的NLRP3激活及检测系统也尚未建立。因此，本研究旨在建立马源NLRP3激活筛选系统，并应用此系统开展EIAV感染后对NLRP3的激活及调控机制的研究。为此，本研究从病毒感染马组织中提取RNA，并以此为模板，扩增获得了马源NLRP3、IL-1β和caspase-1的序列，并构建了相应的表达载体，纯化重组蛋白，将其作为免疫原分别免疫鼠和兔，成功制各并纯化了马源NLRP3单抗、IL-1β和caspase-l的多抗。Western blot结果表明，这些抗体均能特异性识别293T细胞转染后相应蛋白(NLRP3、IL-1β和caspase-1)的外源性表达。同时，也可检测马源细胞中相应蛋白的内源性表达，且具有较高的特异性和敏感性。另外，利用分泌型荧光素酶Gluc报告质粒和马NLRP3炎症小体复合中的相应质粒，成功构建了马NLRP3炎症小体的体外激活报告系统。在此基础上，初步对EIAV感染后NLRP3炎症小体的激活情况进行了探讨。研究发现，EIAV强毒感染12h后，上清中和细胞内的IL-1β和caspase-1的蛋白水平明显增加，且NLRP3在胞浆内的聚集增多。同时，NLRP3炎症小体复合物的关键蛋白ASC也形成了ASC斑点聚集的特异性激活特征。上述结果说明，EIAV强毒感染后能有效地激活NLRP3炎症小体。随后，利用建立的NLRP3激活筛选系统，发现了Env蛋白可以有效地激活NLRP3，Co-IP及PLA实验结果也证实了Env蛋白可以和NLRP3结合。但Env蛋白是如何调控NLRP3激活的机制仍需后续研究。 综上所述，本研究成功制备了马源NLRP3单抗、马源IL-1β和caspase-1多抗。成功构建了基于Gluc报告质粒的马源NLRP3炎症小体体外激活系统，并筛选到可以与NLRP3作用的EIAV病毒蛋白。本研究结果为研究马相关病毒激活炎症反应提供了有效的生物学工具，并为进一步研究EIAV激活和调控NLRP3炎症小体的机制奠定了重要基础。