人α-乳清白蛋白基因的克隆及其转基因小鼠模型的建立

摘要

该文为了得到α-乳清白蛋白基因并建立该基因的转基因小鼠模型,我们使用人粘粒文库来筛选该基因.筛库方法是以PCR技术为基础,并克服了粘粒克隆扩增的不均一性.从扩增一次的粘粒文库中,最后筛选到2个人α-乳清白蛋白基因阳性克隆(45Kb-55Kb);特异引物直接对粘粒阳性克隆进行部分序列测定及鉴定分析,结果进一步证明该阳性克隆含有不完全的人α-乳清白蛋白基因,其3'端缺失,5'端长约40kb,并绘出了该阳性克隆约10kb的片段物理图谱.PCR扩增出缺失的3'端,然后构建成α-乳清白蛋白基因载体,并进行转基因小鼠试验,结果表明三只转基因小鼠奶样较对照奶样多出一条带,其分子量与人α-乳清白蛋白的分子量(14.2KDa)相当,初步估计其表达量为0.2~0.4mg/ml.

目录

第一章文献综述

1 α-乳清蛋白及其基因的研究概况

1.1引言

1.2 α-乳清蛋白的一级、二级和三级结构

1.3 α-乳清蛋白与阳离子的结合

1.4 N末端突变对α-乳清白蛋白特性的影响

1.5 α-乳清白蛋白的熔球状态

1.6 α-乳清白蛋白与小分子有机物和多肽的结合

1.7 α-乳清白蛋白与膜系统的作用

1.8 α-乳清白蛋白的功能

1.9 α-乳清白蛋白的进化

1.10 α-乳清白蛋白基因的结构

2乳蛋白基因的转录调控机理

2.1乳蛋白表达的几种重要的转录因子

2.2乳蛋白基因的转录调控

第二章材料与方法

1材料

2方法

3.分析工具软件及网址

第三章结果

1人α-乳清白蛋白基因粘粒阳性克隆的筛选

1.1粘粒文库的再次扩增及PCR筛选阳性管

1.2 PCR筛选阳性菌落平板

1.3含人α-乳清白蛋白基因阳性粘粒克隆的鉴定

2人α-乳清白蛋白粘粒克隆鉴定及其全基因的获得

2.1酶切鉴定粘粒阳性克隆KYL-LA1

2.2测序鉴定粘粒克隆KYL-LA1

2.3粘粒阳性克隆KYL-LA1多个酶的单酶切和Southern杂交结果

2.4粘粒阳性克隆KYL-LA1的亚克隆KYL-LA1’及其酶切结果

2.5人α-乳清白蛋白基因5’端约10kb的酶切图谱建立

2.6人α-乳清白蛋白全基因克隆的获得

2.7对KYL-hLa1和KYL-hLa4克隆的测序鉴定

3转基因小鼠模型的建立及检测

3.1转基因小鼠模型的建立

3.2转基因小鼠的检测

3.3转基因表达产物的检测

第四章讨论

1关于粘粒文库

2关于粘粒文库构建

3筛库方法的改进

4确定α-乳清白蛋白基因3’端缺失位点

5人α-乳清白蛋白基因的补全

6内含子单碱基的替代对表达的影响

7快速鉴定阳性片段的方法

8关于转基因小鼠

9关于基因组Southern杂交

10关于PCR和Southern检测敏感度的

11关于对乳蛋白基因调控表达问题的思考

第五章结论

第六章参考文献

致谢