利用寡核苷酸芯片对Roundup Ready转基因大豆检测及鉴定技术的研究

摘要

面对愈来愈复杂的正在研究和即将上市的转基因植物,传统的目前应用最广泛的PCR检测技术已不能完全满足大量、快速和对未知转基因产品检测的要求.基因芯片技术的出现,实现了对样品的高通量检测与筛选,检测效率是传统检测手段的成百上千倍.但目前基因芯片技术(寡核苷酸微阵列)应用于转基因检测的研究不仅仅处于初期阶段.该研究选取其遗传背景信息清楚,商业化应用非常广泛的转基因模式植物-Roundup Ready转基因大豆作为主要研究材料,Bt176和Bt11转基因玉米为辅助研究材料,将寡核苷酸芯片检测技术应用于Roundup Ready转基因大豆检测及鉴定的研究,对以下几方面的问题进行了研究和探讨.一、针对Roundup Ready转基因大豆的基因盒结构及其它对照转基因材料就筛选基因,种属相关基因,目的基因,交联结构基因,特异结构基因等15个基因进行了普通PCR扩增并测序鉴定.每个基因的扩增都以转基因和非转基因模板DNA对照进行.结果表明,按CTAB法提取的DNA符合PCR扩增要求,转基因和非转基因模板DNA对每个目的基因的扩增都与预期结果一致,说明PCR反应体系正常,模板DNA未被污染.对每个目的片段的直接测序结果与设计的引物扩增片段序列相符.二、制备检测及鉴定Roundup Ready转基因大豆的寡核苷酸芯片;测序结果包含探针序列或互补序列,所产生的有效信号与预期结果一致,与凝胶电泳检测结果相符,表明所制备的寡核苷酸芯片特异性好;寡核苷酸芯片检测灵敏度及特异性要优于凝胶电泳法检测.三、对芯片检测中常用的两种荧光标记法-随机引物荧光标记法和PCR反应荧光标记进行了比较研究.从检测特异性,信号强度,信噪比指标进行综合评价,对转基因检测的寡核苷酸芯片配合PCR反应荧光标记法为佳.四、针对Roundup Ready转基因大豆建立及优化了两套多重PCR反应体系(分别为四重及五重PCR反应),两套多重PCR产物混合杂交,可在一张芯片上同时检测8个相关基因,从而实现利用该寡核苷酸芯片完成对Roundup Ready转基因大豆检测及鉴定的目的.五、对Bt176和Bt11转基因玉米和非转基因玉米建立及优化了五重PCR反应体系;现有寡核苷酸芯片可有效检测及鉴定Bt176和Bt11转基因玉米,确证该寡核苷酸芯片的特异性能良好.六、针对影响多重PCR产物杂交信号的有关因素进行优化,并与通常使用的杂交体系进行比较,结果表明,杂交时间宜为40分钟,SSC浓度宜采用5×SSC外,杂交温度,甲酰胺浓度与通常杂交条件无异,强调荧光标记好的PCR产物杂交前要进行变性处理.该课题的开发和研究结果为寡核苷酸芯片技术应用于转基因检测作了有益的探索和研究,并为今后实现制备更高密度寡核苷酸芯片扩大对转基因植物的检测奠定了基础.

目录

文摘

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缩略词

主要实验材料

第一章文献综述

1.1目前各国应对转基因产品GMO安全性管理的主要措施-标识法

1.2.转基因产品(GMO)检测技术的研究进展

1.3基因芯片(microarray)技术的研究进展

1.4转基因模式植物-RoundupReady转基因大豆

1.5研究目的和内容

第二章寡核苷酸芯片的制备

2.1外源基因的PCR检测及鉴定

2.2探针的特异性

2.2.1材料与方法

2.2.2结果分析

2.2.3讨论与小结

2.3芯片检测方法的灵敏度评价

第三章两种不同荧光标记方法的比较研究

第四章寡核苷酸芯片对Roundup Ready转基因大豆的检测及鉴定

4.1基于寡核苷酸芯片对Roundup Ready转基因大豆的检测及鉴定

4.2利用检测Roundup Ready转基因大豆的寡核苷酸芯片对Bt176，Bt11转基因玉米的检测及鉴定

第五章杂交反应体系的优化

第六章全文总结

参考文献

致谢

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