长寿老人源双歧杆菌优良菌株的筛选及生理功能研究

摘要

目前,在中国乃至世界范围内,优良乳酸菌资源的开发和利用已成为热点.该课题针对国内外双歧杆菌的研究现状、存在的问题等,以世界第四长寿区—广西巴马百岁以上长寿老人源双歧杆菌为试材,从优良菌种的筛选、生物学特性研究、生理功能探讨与验证等方面进行了较为系统、全面的研究,以期为中国安全、优质、高效的食品双歧杆菌发酵剂及活菌制剂的研制与开发提供理论依据、微生物资源及技术支持.具体从以下几个方面展开研究工作:1.以人结肠腺癌细胞系HT-29细胞为试材,对来源于长寿老人肠道的24株双歧杆菌进行了体外黏附试验.结果发现,双歧杆菌均具有一定的黏附能力,其中的TTF、Z2、TZ5、J-1菌株具有较高的黏附能力.进一步对4株初筛双歧杆菌耐胃酸、胆汁酸和合成B族维生素能力的试验发现,双歧杆菌TTF菌株不仅能合成较高的B<,1>、B<,2>、B<,6>、B<,12>等多种B族维生素,而且在pH3.0的条件下处理120min存活率达93.11﹪,同时在2﹪胆盐浓度下处理24h有较好的存活,具有显著的综合优势.通过形态学、生理生化等相关指标的鉴定该菌株为长双歧杆菌.2.以筛选的长双歧杆菌TTF菌株为试验菌对其生长规律、最佳生长培养基、最适生长温度、起始pH值、促生长因子等生物学特性进行了研究.结果发现:1)长双歧杆菌TTF菌株在MRS、改良MRS和PTYG三种培养基中的生长以改良MRS培养基为最佳.通常培养6h进入对数期,12h进入稳定期,最适生长温度为37℃,最适起始pH值为7.5,活菌数对数值最高可达9.72.2)某些食品原料可作为双歧因子选择性促进双歧杆菌的生长.3.对长双歧杆菌TTF与HT-29细胞黏附的相关因素、与常见抗生素、中草药的药敏性、体外清除活性氧自由基能力、增强机体免疫功能、润肠通便功能、维持和修复机体肠道正常菌群平衡作用等生理功能进行了较为全面的研究.研究结果为:1)以金黄色葡萄球菌ATCC 25923为质控菌,长双歧杆菌TTF对8类30种常用抗生素的药敏性为对大环内酯类、头孢素类、青霉素类、β-内酰胺酶抑制剂的复合物及其他类的氯霉素、呋喃妥因、利福平抗生素均敏感;对氨基糖苷类、糖肽类抗生素均耐药;对四环素类抗生素表现出不同的药敏性.长双歧杆菌TTF菌株经质粒DNA的检测发现不含有质粒,说明其对药物的耐受性不为质粒编码,该菌不存在耐药因子传递的危险,可作为发酵食品或活菌制剂用安全菌种使用.2)三类不同药效的中草药对长双歧杆菌TTF体外生长的影响是不同的,除补益类中药可显著中进其生长外(P<0.05),清热解毒类中药在1﹪、5﹪和10﹪三个试验浓度下随着浓度的增加抑制作用增强但均未达到显著性差异(P>0.05),而泻下类中药对受试菌均有显著的抑制作用(P<0.05)且大黄和芒硝达到极显著水平(P<0.01).3)长双歧杆菌TTF对HT-29细胞具有很强的黏附能力,其黏附作用受细菌浓度、细菌与细胞相互用用时间、温度和pH值等的影响,并在一定范围内具有依赖性.胰蛋白酶处理双歧杆菌TTF表面结构可导致其黏附的降低,说明长双歧杆菌TTF菌体表面的蛋白质可能是细菌黏附素的主要组成成分.4)在模型组成立的前提下,三组受试物组的小鼠首次排黑便时间、排便重量二项指标均极显著优于模型对照组和阴性对照组(P<0.01),但排便粒数没有明显的差异.5)长双歧杆菌TTF不同处理物灌胃盐酸林可霉素(LH)造成的菌群失调小鼠后可使肠道内双歧杆菌和乳杆菌极显著增加(P<0.01),产气荚膜梭菌显著降低(P<0.05),肠杆菌、拟杆菌、肠球菌极显著降低(P<0.01),说明该双歧杆菌无论LB、IE还是SCS均可起到修复与调节机体肠道微生态平衡的作用.6)长双歧杆菌TTF三种受试物对环磷酰胺(Cy)造成的IDMM三项免疫指标均有显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)影响,在该试验选取的三个剂量范围内基本呈量效关系.7)采用比色法、微量发光法和ESR法对长双歧杆菌TTF不同处理物体外清除活性氧自由基能力的研究结果表明,三种处理物均有一定的清除·OH和O<,2><'->的能力,且在该试验条件下与对照组相比达显著性差异(P<0.05),但不同的处理物组对两种氧自由基的清除能力不同,具体表现为SCE>IE>LB.

目录

文摘

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缩略词表

第一章文献综述

1.1双歧杆菌生物学特性

1.1.1形态

1.1.2生活条件

1.1.3代谢途径

1.1.4对抗生素药物的敏感性

1.1.5存在与分类

1.2双歧杆菌的生理作用

1.2.1抗菌性

1.2.2生物拮抗作用

1.2.3营养作用

1.2.4改善乳糖消化不良症

1.2.5改善维生素的代谢

1.2.6防治高血压和动脉硬化

1.2.7降低血液中氨和游离酚的作用

1.2.8对人体胆固醇的吸收

1.2.9对癫痫病的治疗

1.2.10防止便秘

1.2.11治疗慢性腹泻

1.2.12 NO的胃黏膜保护作用

1.2.13改善肝功能

1.2.14抗肿瘤作用

1.2.15增强免疫作用

1.2.16延缓衰老作用

1.2.17控制内毒素血症作用

1.2.18提高宿主对放射线的耐受性

1.3双歧杆菌生物工程研究热点

1.3.1耐氧性能好的双歧杆菌菌株的选育

1.3.2双歧杆菌产生的相关酶系

1.3.3双歧杆菌的黏附性与定植能力

1.3.4双歧杆菌与自由基的关系

1.3.5无耐药因子双歧杆菌菌株选育及耐药性研究

1.3.6双歧杆菌促生长因子研究

1.3.7中药与双歧杆菌等肠道菌群相互关系研究

1.3.8双歧杆菌抑菌活性代谢产物-细菌素

1.3.9双歧杆菌活性代谢产物-胞外多糖

1.4双歧杆菌产品开发与应用

1.4.1双歧杆菌产品开发与应用的现状

1.4.2双歧杆菌产品开发与研究方向

1.4.3双歧杆菌产品开发利用展望

1.5本课题研究目的和意义

1.5.1本课题研究背景

1.5.2本课题研究目的意义

1.5.3本课题主要研究内容与路线

第二章双歧杆菌优良菌株的筛选

2.1前言

2.2材料与方法

2.2.1材料与试剂

2.2.2仪器与设备

2.2.3试验方法

2.3结果与分析

2.3.1 24株双歧杆菌对HT-29细胞的黏附

2.3.2四株初筛双歧杆菌菌株合成B族维生素的能力

2.3.3四株初筛双歧杆菌菌株耐胃酸、胆汁酸的能力

2.4讨论

2.4.1有关黏附实验

2.4.2有关乳酸菌耐胃酸、胆汁酸研究

2.5本章小节

第三章双歧杆菌TTF菌株的鉴定与生长特性研究

3.1前言

3.2材料与方法

3.2.1材料

3.2.2菌种鉴定相关指标与方法

3.2.3 TTF菌株生物学特性测定指标与方法

3.3结果与分析

3.3.1双歧杆菌TTF菌株的鉴定(凌代文，1999)

3.3.2B.Longum TTF菌株生长特性研究

3.4本章小结

第四章长双歧杆菌TTF菌株体外促生长因子研究

4.1前言

4.2材料与方法

4.2.1材料

4.2.2主要仪器设备

4.2.3试验方法

4.3结果与讨论

4.3.1不同低聚糖对长双歧杆菌TTF菌株的体外促生长效果

4.3.2几种常用食品原料对长双歧杆菌TTF菌株的体外促生长效果

4.4 讨论

4.5本章小结

第五章长双歧杆菌TTF菌株的耐药性研究

5.1前言

5.2材料与方法

5.2.1试验菌种

5.2.2主要试剂

5.2.3主要仪器

5.2.4试验方法

5.3结果与分析

5.3.1 B.longum TTF菌株的质粒DNA分析

5.3.2B.longum TTF菌株对常用抗生素的药敏性

5.4讨论

5.4.1不同类抗生素的抗菌机理

5.4.2有关药敏测试方法

5.4.3乳酸菌药敏性研究

5.4.4有关本试验的进一步工作

5.5本章小结

第六章常用中草药对长双歧杆菌TTF菌株生长的影响

6.1前言

6.2材料与方法

6.2.1材料

6.2.2试验方法

6.3结果与分析

6.3.1清热解毒类中药对双歧杆菌TTF和Z2菌株体外生长的影响

6.3.2泻下类中药对双歧杆菌TTF和Z2菌株体外生长的影响

6.3.3补益类中药对双歧杆菌TTF和Z2菌株体外生长的影响

6.4讨论

6.5本章小节

第七章TTF菌株体外黏附人结肠腺癌细胞系HT-29细胞的研究

7.1前言

7.2材料与方法

7.2.1材料

7.2.2培养方法

7.2.3黏附试验

7.2.4考察指标及方法

7.2.5统计学处理

7.3结果与分析

7.3.1B.longum TTF菌株黏附HT-29细胞的形态图

7.3.2不同因素对长双歧杆菌TTF菌株黏附HT-29细胞的影响

7.4讨论

7.4.1关于双歧杆菌黏附对菌量和时间的依赖性

7.4.2关于双歧杆菌菌龄与黏附的关系

7.4.3关于双歧杆菌黏附与pH值的关系

7.4.4关于双歧杆菌黏附的介导物质

7.5本章小结

第八章长双歧杆菌TTF菌株润肠通便功效研究

8.1前言

8.2材料与方法

8.2.1材料

8.2.2三种受试物的制备

8.2.3主要仪器设备

8.2.4内容与方法

8.3结果与分析

8.3.1双歧杆菌TTF不同处理物对正常小鼠排便粒数和排便重量的影响

8.3.2双歧杆菌TTF不同处理物对便秘小鼠排便时间、排便粒数和排便重量的影响

8.4讨论

8.5本章小结

第九章长双歧杆菌TTF菌株调节肠道菌群平衡研究

9.1前言

9.2材料与方法

9.2.1材料

9.2.2主要仪器与设备

9.2.3检测指标与方法

9.3结果与分析

9.3.1长双歧杆菌TTF不同处理物对正常小鼠肠道微生物菌群的影响

9.3.2长双歧杆菌TTF不同处理物对菌群失调小鼠肠道微生物菌群的影响

9.4讨论

9.4.1抗生素与肠道菌群平衡

9.4.2双歧杆菌与肠道菌群平衡

9.5本章小节

第十章长双歧杆菌TTF菌株增强机体免疫活性的研究

10.1前言

10.2材料与方法

10.2.1试验材料

10.2.2主要仪器

10.2.3测定指标与方法

10.3结果与讨论

10.3.1双歧杆菌活菌体、菌体破碎物和发酵上清液对IDMM免疫脏器指数的影响

10.3.2双歧杆菌活菌、菌体破碎物和发酵上清液对IDMM免疫活性的影响

10.3.3双歧杆菌活菌、菌体破碎物和发酵上清液对正常小鼠免疫活性的影响

10.3.4双歧杆菌活菌、菌体破碎物和发酵上清液的急性毒性试验

10.4本章小结

第十一章长双歧杆菌TTF体外清除活性氧自由基研究

11.1前言

11.2材料与方法

11.2.1实验材料

11.2.2主要仪器

11.2.3主要试剂

11.2.4试验内容与方法

11.3结果与分析

11.3.1比色法检测双歧杆菌TTF不同处理物清除氧自由基的能力

11.3.2化学发光法检测双歧杆菌TTF不同处理物清除氧自由基的能力

11.3.3 ESR法检测双歧杆菌TTF不同处理物清除氧自由基的能力

11.4讨论

11.4.1自由基相关研究

11.4.2有关氧自由基的检测方法

11.4.3有关细菌抗氧化性的能力

11.5本章小结

第十二章全文总结与展望

12.1结论

12.2工作展望

参考文献

附录及附图

致谢

作者简历