动物性产品中磺胺类和喹诺酮类等兽药残留的免疫分析检测技术研究

摘要

近年米，食品安全问题，尤其是动物性产品中兽药残留超标的问题，引起了全世界的普遍关注，发展灵敏高、速度快、价格低的药物残留检测技术是保障食品安全的关键之一。传统的仪器分析方法前处理过程复杂、仪器昂贵、效率低下，不能适应以筛选为目的人量检测样本的分析，免疫分析方法具备灵敏度高、特异性高、方便和成本低等优点，越米越多的应用到兽药残留检测。 本文以荧光素异硫氰酸钠(fluorescein isothiocyanate，FITC)和二氯三嗪基氨基荧光素(dichlorotriazinylaminofluorescein，DTAF)标记磺胺类药物(Salfonamides，SAs)和马杜霉素(Maduramicin，MD)，得到荧光标记药物。首次系统研究了荧光偏振免疫分析(Fluorescence Polarization Immunoassay，FPIA)检测动物性产品中SAs和MD的残留。同时制备了喹诺酮类(Fluoroquinolones，FQs)药物的单克隆抗体(Monoclonal antibody，Mab)，建立了可以同时检测12种FQs的多残留ELISA方法。 以磺胺二甲基嘧啶(Sulfamethazine，SMZ)的多抗(Polyclonal antibody，Pab)和单抗建立了SMZ的FPIA检测方法。多抗的IC<,50>为41 ng mL<'-1>；单抗得到的灵敏度较高IC<,50>为16 ng mL<'-1>，添加空白鸡肉平均回收率为76-89％，批间变异系数为7.4-9.6％；建立了同时检测牛奶中磺胺甲氧吡嗪(Sulfamethoxypyridazine，SMP)和磺胺氯吡嗪(Sulfachloropyridazine，SCP)残留的FPIA方法，对SMP和SCP的IC<,50>分别为11.5和29 ngmL<'-1>，检测系统可以耐受20％的甲醇存在，在pH值4-8利低盐离子浓度环境中均能得剑较好的灵敏度，牛奶样本中的SMP残留和SCP残留的平均同收率为60-145％，平均变异系数为8.6-12.8％；建立了同时检测蜂蜜和鸡肉中磺胺甲基嘧啶(Sufamerazine，SMR)、SMZ和磺胺嘧啶(Sulfadiazine，SDZ)残留的FPIA方法，IC<,50>分别为19、65.7和137 ng mL<'-1>，添加空白蜂蜜和鸡肉样本的平均同收率为89-131％，平均变异系数在10％左右：建立了鸡肉、鸡蛋和鸡脂肪中MD残留的FPlA检测方法， IC<,50>为160 ng mL<'-1>，添加空白鸡肉、鸡蛋和鸡脂肪平均同收率为82-130％，变异系数为7-15.5％。 建立了5种动物性产品12种FQs多残留的ELISA检测方法，以单抗C4A9H1建立的ELISA方法对12种FQs的交义反应率在35-100％之间，在MRLs水平下至少可以检测12种FQs。建立的ELISA方法应用到鸡肉、鸡肝脏、虾、蜂蜜和鸡蛋5种样本中12种FQs的残留检测，平均同收率为60.2-92.5％，变异系数为5.6-16.5％。 本文通过计算17种SAs的最低能量构象，研究了SMZ多抗和SMR单抗对17种SAs亲和力的构效关系(Structure Activity Relationship，SAR)。结果表明，水合能和Log P值在SAs与SMZ抗体结合的过程中发挥重要作用。应用比较分子立场分析方法(Comparism Molecular Field Analysis，CoMFA)求出了8种SAs与SMR单抗的定量构效关系(Quantitative Structure Activity Relationship，QSAR)，得剑的交义验证相关平方系数q<'2>为0.634，由最佳主成分验证得剑的结果r<'2>为1，即计算值与实验值完全一致。构建了14种FQs分子的三维立体结构利静电荷分布图，讨论了FQs的分子结构与单抗C4A9H1对FQs亲和力的关系，应用 CoMFA算法计算山FQs分子与抗体亲和力之间的QSAR，r<'2>为0.999，q<'2>为0.866。首次证明抗体与抗原之间存在精确的QSAR关系。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语表、图表目录

声明

第一章引言

1荧光偏振免疫分析在药物残留检测中的研究进展

1.1荧光偏振免疫分析的历史和原理

1.2荧光偏振免疫分析的优点和缺点

1.3荧光偏振免疫分析的最新进展

1.4荧光偏振免疫分析在农药和兽药残留检测中的应用

1.5结论

2磺胺类、喹诺酮类和马杜霉素药物免疫检测方法综述

2.1磺胺类药物免疫检测方法综述

2.2喹诺酮类药物免疫检测方法综述

2.3马杜霉素免疫检测方法综述

3分子理论计算概述

3.1量子化学

3.2分子力学

3.3比较分子力场分析法

3.4分子计算技术药物-抗体结合中的应用

4研究的内容和方法

4.1研究内容

4.2研究方法

第二章抗体的制备

1材料与方法

1.1试剂

1.2方法

2结果与分析

2.1免疫原的鉴定

2.2抗体的鉴定

3讨论

3.1 SMZ多克隆抗体制备

3.2 FQs单克隆抗体制备

第三章荧光标记抗原的制备

1材料与方法

1.1材料

1.2实验方法

2结果与分析

2.1 SMZ-FITC的鉴定

2.2 SMZ-DTAF的鉴定

2.3 EDF的鉴定

2.4 MD-EDF的鉴定

3讨论

3.1荧光标记物的浓度

3.2荧光素的种类

第四章磺胺类药物和马杜霉素的荧光偏振免疫分析研究

1材料与方法

1.1材料

1.2方法

2结果与分析

2.1磺胺二甲基嘧啶FPIA研究

2.2磺胺甲氧吡嗪FPIA研究

2.3磺胺甲基嘧啶FPIA研究

2.4马杜霉素FPIA研究

3讨论

3.1抗体浓度

3.2荧光标记物

3.3理化因素对IC50的影响

3.4添加回收率

3.5 QSAR研究

第五章喹诺酮类药物多残留ELISA检测方法的研究

1材料和方法

1.1材料

1.2方法

2结果与分析

2.1包被溶液、封闭液、抗体稀释液和酶标二抗稀释液的确定

2.2包被原稀释度和抗体稀释度的确定

2.3竞争时间的选择

2.4显色时间的选择

2.5抗原与抗体体积比的选择

2.6条件的综合和交叉反应性的测定

2.7 QSAR研究

2.8添加回收率

3讨论

3.1影响ELISA参数的因素

3.2 QSAR研究

第六章结论

1建立了检测鸡肉中SMZ残留的FPIA方法

2研究了SMZ多抗与17种SAs的SAR关系

3建立了同时检测牛奶中SMP和SCP的FPIA方法

4建立了同时检测鸡肉和蜂蜜中SMR、SMZ和SDZ的FPIA方法

5研究了SMR单抗与8种SAs的QSAR关系

6建立了检测鸡肉、鸡脂肪和鸡蛋中MD的FPIA方法

7制备了FQs的单抗，建立了检测12种FQs的多残留ELISA方法

8研究了单抗C4A9H1与14种FQs的QSAR关系

参考文献

致 谢

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