利用猪单个胚胎建立高效快速的CRISPR/Cas9打靶位点检测方法

摘要

背景: 家猪的遗传、生理及神经功能与人类高度相似，使其在生物医学研究中占据非常重要的地位。高效精确的基因修饰猪是生物医药研究的理想动物模型之一，也是研究疾病发生机理和探索潜在治疗手段的重要基础。人源化免疫排斥缺陷小型猪更是异种器官移植的理想供体。传统的基因组编辑技术主要基于胚胎干细胞和同源重组技术以及转基因体细胞克隆技术实现哺乳动物基因组的定向编辑，但这些技术较低的效率严重制约了基因工程动物在生物医药中的研究与应用。 CRISPR/Cas9系统是近年基因编辑的研究热点，具有设计灵活，实验周期短和编辑效率高等特点。然而，由于漫长的妊娠期和圈养高成本，在一次实际实验完成后利用来自胎儿或新生仔猪的染色质样本，来明确在修饰的猪基因组的靶序列中存在插入缺失突变，是具有挑战性的。此外，要获得足够数量的体内衍生受精卵，就必需密集劳动和众多母猪。因此，胚胎水平快速、高效的验证Cas9打靶位点是利用该方法成功制备基因编辑动物的关键点。一种优化的CRISPR/Cas9基因工程猪系统，可以最大限度地发挥遗传修饰的效率。 本课题研究CRISPR/Cas9基因编辑系统在猪胚胎中多基因修饰的效率，并为高效、快速和经济的构建多基因修饰猪模型奠定基础。 目的: 1、验证两个打靶位点的基因编辑效率比一个打靶位点的基因编辑效率高。 2、探讨猪孤雌胚胎中CRISPR/Cas9系统的多基因编辑效率，以模拟在体实验。 3、在猪胚胎中敲出免疫排斥相关基因或者脂代谢相关基因，为构建异种器官移植供体猪及脂代谢相关疾病猪模型提供技术依据。 方法: 1、检测打靶位点是否存在单核苷酸位点多态性(SNP):根据靶位点的位置，采用PCR的方法将靶位点上下游片段扩增出来后进行测序检测是否存在SNP。 2、U6-sgRNA表达载体构建及效率检测:针对猪B2M、CIITA、GGTA1、LDLR、LEP和LEPR基因组DNA序列，每个基因设计一对sgRNAs，合成U6-sgRNA寡核苷酸链，退火后，克隆至pGL3真核表达载体中;在猪PIEC细胞上检测sgRNA切割效率。 3、T7-sgRNA表达载体构建:将设计好的一对sgRNAs分别合成T7-sgRNA寡核苷酸链，经退火、连接和转化后，克隆至pUC57-sgRNA表达载体中。 4、体外转录: 体外转录Cas9质粒:Age1线性化pST1374-Cas9质粒，应用T7 Ultra试剂盒进行体外转录实验，转录后的Cas9 mRNA应用RNeasy Mini试剂盒纯化，分装转录产物冻于-80℃保存。 体外转录sgRNA质粒:采用PCR方法扩增出pUC57-sgRNA表达载体上的T7启动子和sgRNA序列作为转录模板，应用MEGAshortscript试剂盒进行体外转录，转录产物用MEGAclear试剂盒纯化，分装转录产物冻于-80℃保存。 5、T7核酸内切酶Ⅰ(T7EN1)检测基因编辑效率:将Cas9 mRNA和sgRNAs通过显微注射的方式注入猪卵细胞中，待其发育至囊胚后，采用PCR方法将打靶位点上下游基因扩增出来，产生各种不同基因突变的PCR片段，纯化PCR产物后经过退火，各种不完美互补配对的单链产物随机组合到一起，形成发夹样或泡状结构。T7核酸内切酶I能够识别这种结构并将该处双链DNA切断，通过凝胶电泳可判断Cas9/sgRNA切割效率。 6、脱靶效应检测:根据打靶位点序列，结合对猪全基因组序列进行分析，找到所有潜在的脱靶位点。在允许与sgRNA序列4个以下碱基错配的前提下，对两个胚胎、共六个sgRNA的靶位点选取共30个容易发生脱靶效应的位点、采用T7EN1实验进行检测，对检测到突变的PCR产物进行T-A克隆测序加以确认。 结果: 1、靶位点不存在SNP的:应用PCR方式对靶位点上下游序列进行扩增，PCR产物测序结果与NCBI上猪B2M、CIITA、GGTAI、LDLR、LEP和LEPR基因相应序列一致，不存在SNP。 2、成功构建U6-sgRNA和T7-sgRNA表达载体:将合成的sgRNAs寡核苷酸链，分别克隆至pGL3-sgRNA和pUC57-sgRNA质粒中，经测序后结果正确，说明成功构建了U6-sgRNA和T7-sgRNA表达载体。 3、Cas9+dual sgRNA与Cas9+single sgRNA相比在PIEC细胞上能够高效进行基因编辑:分别将Cas9-B2M sg1/sg2/sg1+2，Cas9-CIITA sg1/sg2/sg1+2，Cas9-GGTA1 sg1/sg2/sg1+2转染PIEC细胞72h后，裂解细胞并提取基因组，采用T7EN1实验检测基因编辑效率，结果显示Cas9-sgRNA1+2比Cas9-sgRNA1/2对PIEC细胞基因组能产生较强的切割条带，T-A克隆测序结果显示转染Cas9-sgRNA1+2切割效率能够达到87.5％，而转染Cas9-sgRNA1/2的效率约为55％。 4、体外转录:体外转录Cas9、Cas9-D10A和sgRNAs表达载体，转录产物经纯化后进行凝胶电泳，以确认其完整性。结果显示Cas9 mRNA和sgRNA条带单一，表明无降解现象，其条带大小与预期结果一致。以上说明我们成功转录出Cas9 mRNA和sgRNA。 5、多基因修饰猪孤雌胚胎的获取:通过显微注射的方法将sgRNA和Cas9mRNA注射入单细胞期的孤雌胚胎中，待其发育为囊胚后检测打靶效率。T7EN1酶切和TA克隆测序结果表明本研究可以在猪的孤雌胚胎中同时实现三个基因(B2M、CIITA和GGTA1或LDLR、LEP和LEPR)的高效敲除（分别为62.5％和50％）。 6、脱靶效应分析:根据sgRNAs+PAM(23bp)作用靶点序列，对多基因敲出的囊胚在潜在脱靶位点采用T7核酸内切酶Ⅰ方式检测突变。结果显示两枚胚胎、六个sgRNA的潜在的30个脱靶位点均未见突变。 结论: 结果表明双sgRNAs比单个sgRNA在PIEC细胞系中具有更高的基因编辑效率;CRISPR/Cas9能够在猪孤雌胚胎中进行多基因同时修饰;建立了利用单枚孤雌胚胎快速检测CRISPR/Cas9基因编辑效率的方法。