水平基底细胞YAP在嗅上皮损伤修复过程中作用及机制研究

摘要

嗅觉是人类重要信息的来源渠道，可以感知环境、判断危险和识别事物，拥有良好的嗅觉是人类健康生存的重要条件。嗅觉障碍患者发生意外的几率是嗅觉正常者的2倍，严重影响患者的生活质量，给患者家庭和社会带来较大的痛苦和压力。此外，嗅觉障碍会出现在各种临床疾病中，比如阿尔茨海默症（Alzheimer''s disease，AD）。据报道阿尔茨海默病早期就能在嗅上皮观察到β-淀粉样沉积，并伴随嗅神经元明显减少。 嗅觉神经元可以感应气体分子并将其转化为电信号，是完成嗅觉传递的关键。但嗅觉神经元直接暴露于外界环境，易受各种因素的损伤导致死亡。一般而言，哺乳动物中枢神经系统的神经元损伤后难以再生和恢复，但嗅觉神经元可不断再生，每隔1-3个月更新一次。这种强大再生能力来源于两种基底干细胞：水平和球形基底细胞。水平基底细胞一般处于休眠状态，在严重损伤后其可增殖分化成其它各种细胞。而球形基底细胞是正常嗅上皮更新的关键。此外，基底细胞可以定向诱导分化成耳蜗毛细胞、肝细胞、骨骼肌细胞和心肌细胞等，故成为重要的移植对象。综上，研究嗅觉损伤后神经再生的分子基础研究具有重要的科学和临床学意义。 Hippo/YAP(Yes-associated protein)信号通路被证明在神经干细胞增殖分化、神经元前体细胞增殖、胶质细胞分化和激活、髓鞘化发育以及神经系统疾病的发生发展等方面发挥重要作用。本团队之前的研究工作表明，YAP作为经典Hippo通路的主要效应因子，参与细胞增殖、分化和神经再生等重要的生理过程，然而YAP在急性嗅上皮损伤后嗅上皮再生中作用尚不清楚。 目的: 本项目主要通过构建急性嗅上皮损伤模型和YAP条件性基因敲除小鼠研究YAP信号在嗅上皮损伤后修复再生过程中的作用及其分子机制，从而为嗅觉障碍机制研究和治疗提供新的思路和靶点。 方法: 1.制备甲巯咪唑（Methimazole,MZ）诱导急性嗅上皮损伤模型，并采用HE染色、埋藏食物小球实验等方法评价该模型是否成功。在此模型基础上，采用Western blot和免疫荧光染色检测YAP在损伤的嗅上皮时空表达分布情况。 2.构建嗅上皮条件性敲除小鼠YAPK5-CKO鼠，采用HE染色、组化和埋藏食物小球等实验检测敲除YAP是否影响嗅觉发育和嗅觉功能。 3.YAPK5-CKO鼠与同窝对照鼠同时造模，通过HE和尼氏染色观察两组小鼠嗅上皮的大体形态和嗅觉功能。进一步通过荧光染色观察水平基底细胞的增殖和分化。 4.通过外源性给予1-磷酸鞘氨醇(Sphingosine1-phosphate,S1P)和S1PR2抑制剂JTE013探究YAP上游S1P/S1PR2通路在嗅上皮损伤后修复的作用，并采用RNA测序分析进一步探究可能的下游通路。 5.激活YAP通路后，采用埋藏食物小球、HE和荧光染色等实验检测激活YAP通路能否促进嗅上皮再生和嗅觉功能恢复。 6.培育APP/PS1AD模型鼠并腹腔注射XMU-MP-1，检测激活YAP是否改善嗅觉上皮再生和AD鼠的嗅觉功能。 结果: 1.YAP主要表达于嗅上皮的水平基底细胞，在嗅上皮急性损伤后，水平基底细胞中的YAP表达上调，被激活。 2.条件性敲除水平基底细胞YAP不影响小鼠嗅上皮发育和嗅觉功能。 3.嗅上皮急性损伤后，条件性敲除水平基底细胞YAP抑制嗅上皮再生和嗅觉功能恢复，与水平基底细胞增殖、嗅觉神经元形成和嗅觉神经元向嗅球的轴突投射抑制有关。 4.机制方面，在嗅上皮损伤后，S1P/S1PR2作为YAP的上游信号分子，在水平基底细胞表达上调，激活YAP，促进嗅上皮再生和嗅觉功能恢复，并且外源性给予S1P会促进嗅上皮修复和嗅觉功能恢复。 5.在嗅上皮急性损伤和AD鼠慢性嗅觉损伤后，激活YAP信号通路促进水平基底细胞的增殖和嗅上皮的再生，并促进嗅觉功能恢复。 结论: 在本研究中，我们发现YAP主要表达于嗅上皮水平基底细胞，且在嗅上皮损伤后，水平基底细胞中YAP表达上调，被激活。条件性敲除水平基底细胞YAP不影响嗅上皮的发育和嗅觉功能；然而在嗅上皮急性损伤后，YAP敲除抑制水平基底细胞的增殖和嗅觉神经元的形成，进而抑制嗅觉功能恢复。进一步机制发现S1P/S1PR2作为YAP信号上游，在损伤后激活水平基底细胞YAP通路，促进水平基底细胞的增殖和嗅觉神经元的形成，以及嗅觉功能恢复。最后，在急性嗅上皮损伤的小鼠和AD鼠（慢性嗅上皮损伤模型鼠）体内使用药物激活YAP信号通路可部分改善其嗅觉功能。我们这些研究结果表明S1PR2-YAP信号通路可促进嗅上皮损伤后修复，也首次揭示了YAP通路在嗅觉神经再生中的作用，这将为嗅觉障碍的恢复提供新的研究思路和治疗靶点。这些研究结果也帮助我们深入地认识水平基底细胞的生物学特性，为水平基底细胞增殖的分子机制和嗅觉损伤研究提供了理论基础。