红芪多糖对糖尿病肾病db/db小鼠肾组织GluT-1、FN和Col-IV表达的影响

摘要

目的:探讨红芪多糖(Hedysaryum Polysaccharide, HPS)保护糖尿病肾病db/db小鼠肾功能的作用机制和对肾脏组织中葡萄糖转运蛋白-1(Glucose Tansporter-1, GluT-1)、纤维连接蛋白( fibronectin, FN)和IV型胶原(collagen IV, Col-IV)mRNA和蛋白表达的影响,阐明其可能机制。
　　方法:采用11周龄雄性SPF级2型糖尿病肾病动物模型db/db小鼠50只和db/m小鼠10只。适应性喂养1周后称体重,检测血糖和尿微量白蛋白(urinary microalbumin, UMALB),确诊db/db小鼠发生早期糖尿病肾病后进入实验。把50只db/db小鼠随机分成5组:模型组,给予生理盐水0.2 ml.d-1;依那普利组,给予依那普利10 mg.kg-1.d-1;HPS低剂量组,给予HPS100 mg.kg-1.d-1;HPS中剂量组,给予HPS200 mg.kg-1.d-1;HPS高剂量组,给予HPS400 mg.kg-1.d-1。10只db/m小鼠作为正常对照组,给予生理盐水0.2 ml.d-1。以上均每日灌胃1次,连续8周。于第8周处死前所有小鼠置代谢笼留取24h尿液,计量后用于测定 UMALB。称重后摘眼球取血标本,用于血肌酐(serum creatinine, SCR)、血尿素氮(blood urea nitrogen, BUN)检测。小鼠处死后立即取肾脏组织,分离皮、髓质。左肾放于-80℃冰箱中保存,用于RT-PCR和Western blotting检测;右肾立即用石蜡包埋,切片后行免疫组化和HE及Masson染色。用苦味酸法测定SCR水平;酶偶联速率法测定BUN水平;ELISA法测定24h UMALB;RT-PCR法测定GluT-1、FN和 Col-IV mRNA的表达;Western blloting法和免疫组化法测定 GluT-1、FN和Col-IV蛋白的表达。
　　结果:(1)肾功能检测:依那普利组、HPS各剂量组小鼠SCR、BUN的值和治疗后UMALB的值均低于模型组,HPS中高剂量组和依那普利组降低明显(P<0.01)。
　　(2)小鼠肾脏GluT-1的表达:依那普利组小鼠肾组织中GluT-1的表达低于模型组(P<0.05或P<0.01);HPS高剂量小鼠肾脏组织中GluT-1蛋白的表达明显低于模型组(P<0.01)。
　　(3)小鼠肾脏FN的表达:依那普利组和HPS高剂量组小鼠肾脏组织中FN的表达均明显低于模型组(P<0.01); HPS中低剂量组小鼠肾脏组织 mRNA和蛋白质的表达均低于模型组(P<0.05或P<0.01)。
　　(4)小鼠肾脏Col-IV的表达:依那普利组和HPS各组小鼠肾脏组织中Col-IV的表达均低于模型组,依那普利差异明显(P<0.01)。随着HPS剂量的增加,肾脏组织棕色颗粒染色面积逐渐减小。
　　(5)肾脏组织HE染色:各治疗组小鼠肾小球结构紊乱程度、毛细血管分布、肾小管走形、管腔通畅度及肾间质的炎症细胞浸润均明显好于模型组。随着 HPS剂量的增加,肾脏病变程度逐渐减轻。
　　(6)肾脏组织 MASSON染色:各治疗组小鼠肾小球结构破坏程度、毛细血管紊乱程度、肾小管管腔通畅度及胶原纤维在肾脏的分布和表达均明显好于模型组。随着HPS剂量的增加,胶原纤维在肾脏的表达和分布逐渐减少。
　　(7)肾脏组织电镜检测:各治疗组小鼠肾小球内皮细胞、系膜细胞、足细胞和肾小管上皮细胞的形态及细胞器、绒毛等微结构均明显好模型组。HPS高剂量组和依那普利组相比,两者之间无明显差异。随着 HPS剂量的增加,以上肾脏微结构病变程度逐渐减轻。
　　结论:(1) DN病理通路上游的GluT-1和下游的FN、Col-IV表达趋势基本一致。(2)HPS通过多种作用机制下调GluT-1、FN和COL-IV的表达,保护肾功能,延缓DN的进展。(3)根据 HPS的药理作用和研究结果可逆向证明糖尿病肾病的病机之一为“肾气不足,化生浊瘀”,为今后防治DN选用补益元气的药物以鼓舞肾气、祛瘀化浊提供了新的理论支持。

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英 文 缩 略 词

前言

第一章 立题依据

1 祖国医学对糖尿病肾病的认识

2 现代医学防治糖尿病肾病研究进展

3 研究背景

4 研究的目的及意义

5 创新点

第二章 实验研究

1 研究内容与方法

2. 研究结果

3讨论

4 结论

问题与展望

参 考 文 献

致谢

附录(一)

附录(二)

附录(三)

附录(四)

附录(五)

附录(六)

附录(七)

附录(八) 动物实验设施使用证

附录（九）实验动物质量合格证