抗秦川黄牛成熟朊蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

摘要

[目的]本研究拟采用秦川黄牛重组成熟朊蛋白(PrP)的纯化复性产物作为免疫原，应用淋巴细胞杂交瘤技术制备出抗牛成熟朊蛋白的单抗(mAb)，为研制疯牛病免疫诊断试剂盒奠定基础。 [方法]将本实验室保存的含有秦川黄牛成熟PrP基因的重组质粒pET30a-PrP(25～242aa)转入大肠杆菌E.coliJM109(DE3)中，IPTG诱导表达，SDS-PAGE分析鉴定表达产物。采用Ni-NTA亲和层析法纯化融合蛋白，透析法复性纯化的重组表达产物，考马斯亮蓝染色法测定蛋白浓度。以SAF70进口单抗为检测抗体，Westernblot分析融合蛋白的免疫反应性和对蛋白酶K的敏感性。以纯化复性的牛成熟PrP融合蛋白作为免疫原，以含有pET30a(+)空载体的E.coliJM109(DE3)的菌体蛋白作为对照免疫原，分别与弗氏完全佐剂1∶1混合乳化，按100μg/只剂量皮下3～4点注射8周龄清洁级BALB/c雌性小鼠，在第4周和第8周皮下注射同等剂量的以弗氏不完全佐剂乳化的免疫原，在第12周按150μg/只剂量直接腹腔注射PBS稀释的免疫原。3d后取PrP融合蛋白免疫小鼠脾细胞与SP2/0细胞在PEG1500作用下室温融合，HAT培养液选择培养，融合10～15d后取细胞上清液进行间接ELISA检测。纯化的牛成熟PrP融合蛋白和pET30a(+)空载体菌体蛋白分别按25μg/mL的工作浓度包被酶标板，融合蛋白免疫小鼠血清1∶960和SAF70单抗1∶300作阳性对照，SP2/0细胞上清液1∶1和对照免疫鼠血清1∶960作阴性对照，加入辣根过氧化酶标记的山羊抗小鼠IgG，测定OD490nm吸收值。凡杂交瘤细胞液的OD490nm值大于阴性对照3倍以上者初步判定为阳性克隆。将阳性克隆N64杂交瘤作有限稀释，3次亚克隆后液氮冻存细胞并连续传代3个月检测杂交瘤分泌抗体的稳定性。将N64杂交瘤细胞按1×106腹腔注射经无菌液体石蜡预处理的BALB/c小鼠制备腹水单抗。以ProteinAAgarose亲和层析法纯化腹水抗体，双抗体夹心法检测N64单抗的Ig类和亚类，间接ELISA法测定纯化的腹水抗体的效价和相对亲和力，Westernblot分析N64单抗的特异性，采用基因片段表达作图法初步分析抗原表位。 [结果]获得了能稳定分泌抗牛成熟朊蛋白的杂交瘤细胞株N64，分泌的抗体属于IgG2a，腹水效价为1×105，相对亲和力为0.2μg/mL。Westernblot表明N64单抗具有较强的特异性，表位分析显示N64单抗仅与羧基端重组朊蛋白反应。

目录

文摘

英文文摘

第一篇文献综述朊蛋白及疯牛病诊断技术研究进展

第二篇研究报告

第一章秦川黄牛重组朊蛋白的制备

第二章抗秦川黄牛成熟朊蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

6致谢

参考文献

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