牛叠朊编码基因缺失突变体的构建及其在大肠杆菌中的表达

摘要

[目的]叠朊是朊蛋白的横向同源物，深入了解叠朊的结构与功能对揭示朊病毒病的发病机制具有重要意义。单克隆抗体是研究蛋白质功能的有力工具，本实验室已制备出多株针对牛叠朊的单克隆抗体，为充分鉴定这些单克隆抗体针对的抗原表位，通过基因克隆表达的策略获取牛叠朊基因缺失突变体的重组蛋白，以期为单克隆抗体的表位鉴定提供物质材料。 [方法]经过对牛成熟叠朊编码基因及预计的蛋白质结构特征的分析，设计表达9个缺失突变体的引物。以聚合酶链式反应扩增出叠朊基因的缺失突变体，与pET-30a（+）表达载体连接后转入E.coliDH5α中，经双酶切和测序鉴定后将重组质粒转入E.coliJM109（DE）3和E.coliBL21（DE）3表达宿主菌中，经异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达后，以聚丙烯酰胺凝胶电泳、免疫印迹和间接酶联免疫吸附分析法检测表达产物的分子量、相对表达量和反应原性。 [结果]重组质粒的双酶切和测序结果表明，牛叠朊基因的9个缺失突变均被正确插入pET-30a（+）表达载体中。聚丙烯酰胺凝胶电泳、免疫印迹和间接酶联免疫吸附分析检测结果表明，有6个缺失突变体被大肠秆菌高效表达，它们分别是：boDPL（61-124），boDPL（72-155），boDPL（87-155），boDPL（58-155），boDPL（27-144），boDPL（27-155）。其余3个缺失突变体重组蛋白的诱导表达条件还有待进一步的摸索。 [结论]成功构建了9个牛叠朊编码基因的缺失突变体，通过IPTG的诱导表达，其中有6个缺失突变体被大肠杆菌高效表达，并且具有较好的反应原性，这为进一步的单克隆抗体的表位鉴定奠定了物质基础。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词

声明

第一章：综述

1.传染性海绵状脑病概况

1.1传染性海绵状脑病的发现

1.2.传染性海绵状脑病的流行病学

1.3传染性海绵状脑病的发病机制

2.朊蛋白的特性

2.1朊蛋白基因的结构特征

2.2朊蛋白和朊病毒的关系

3.叠朊的特征

3.1叠朊蛋白的基因结构特征

3.2叠朊蛋白的分布

3.3叠朊的功能

3.4朊蛋白对叠朊神经毒性的拮抗作用

3.5叠朊在传染性海绵状脑病发病中的作用

4.展望

5.本实验的工作目的、工作内容

第二章牛叠朊基因缺失突变体的构建与鉴定

1.前言

2.材料和方法

2.1材料

2.2方法

3结果

4.讨论

第三章：牛叠朊缺失突变体在大肠杆菌中的表达

1.引言

2.材料和方法

2.1材料

2.2方法

3结果

3.1表达产物检测

4讨论

参考文献

致 谢

作者简介

导师简介