circLMO7靶向miR-145-5p促进猪骨骼肌卫星细胞增殖和分化的作用机制研究

摘要

骨骼肌是评价猪产肉量及肉品质的重要研究对象,其发育过程受蛋白编码基因和非编码RNA共同调节。环状RNA(circular RNA,circRNA)是一类共价封闭的单链RNA分子,在多种生物学过程中发挥着重要的调控作用。然而,环状RNA在猪肌生成过程中的具体作用仍鲜有研究。本研究以出生后1 d、90 d和180 d晋汾白猪背最长肌组织为研究材料,去线性RNA后富集circRNA进行测序,鉴定晋汾白猪骨骼肌发育过程中表达的circRNA,对circRNA进行基因组特征、表达模式和功能富集分析,并构建circRNA/miRNA/mRNA网络。在ceRNA网络图中发现circLMO7与miR-145-5p具有潜在的结合能力,以猪骨骼肌卫星细胞(Skeletal muscle satellite cell,SMSCs)为试验材料,通过过表达和干扰circLMO7和miR-145-5p,分别探究它们对猪SMSCs增殖和分化的影响;通过双荧光素酶报告基因试验对circLMO7与miR-145-5p的结合能力进行验证。主要研究结果如下:1、9个测序文库总共获得16990个高信度circRNAs,在猪不同染色体上均有分布,绝大部分由外显子组成;共鉴定出584个差异表达circRNAs,其来源基因富集分析表明,它们主要参与肌肉收缩、肌肉器官发育和肌肉系统等过程以及AMPK、c AMP等信号通路;构建了包括novel＿circ＿0016243/miR-145-5p在内的DE circRNA–miRNA–mRNA共表达网络。2、novel＿circ＿0016243由LMO7基因的第3、10和11外显子经反向剪接环化形成,故命名为circLMO7,其在猪骨骼肌卫星细胞核质中均有分布;在晋汾白猪肺中表达量最高,皮下脂肪和背最长肌次之;在1 d,90 d和180 d背最长肌中表达量呈现下降的趋势;在猪SMSCs不同分化时间中呈先下降后上升的趋势;circLMO7能上调PCNA、Ki67、CDK1和CDK4的表达,促进Ed U阳性细胞数,增强细胞活性水平,促进猪SMSCs增殖;在分化方面,circLMO7上调MyOD、MyOG和Myf5的表达量,提高MyOD蛋白水平,增加MyHC阳性肌管面积,促进猪SMSCs的分化。3、miR-145-5p基因在晋汾白猪肝和肺中表达量最高,心和皮下脂肪中次之;随着日龄的增加,miR-145-5p在猪背最长肌中的表达量持续升高;miR-145-5p下调PCNA、Ki67、CDK1和CDK4的表达,减少Ed U阳性细胞数,细胞活性水平下降,抑制猪SMSCs增殖;在分化方面,miR-145-5p下调MyOD、MyOG和Myf5的表达量,降低MyOD蛋白水平,MyHC阳性肌管面积减少,抑制猪SMSCs的分化。4、双荧光素酶试验和挽救试验结果表明circLMO7可以作为ceRNA吸附miR-145-5p,促进IGF1R mRNA和蛋白的相对表达水平,影响AKT通路,促进猪SMSCs的增殖和分化。综上所述,circLMO7可以作为ceRNA海绵化miR-145-5p,调控IGF1R的表达,进而介导AKT信号通路,促进猪SMSCs的增殖和分化,进而调控骨骼肌的生长发育过程。研究结果丰富了猪肌肉生长发育的分子网络,为其肌肉性状育种提供分子靶标。

目录

摘要

前言

第一章 文献综述

1 肌纤维的生长发育

1.1 肌纤维的形成

1.2 骨骼肌生长发育的转录调控

2 miRNA研究进展

2.1 miRNA的生成

2.2 miRNA的作用机制

2.3 肌肉生成相关的miRNA

3 circRNA 研究进展

3.1 circRNA 的生物发生

3.2 circRNA 的生物学功能

3.3 circRNA 在动物骨骼肌中的研究进展

4 研究目的与意义

第二章 基于全转录组测序筛选骨骼肌生长发育中差异 circRNAs

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.2 试验方法

2 结果与分析

2.1 总 RNA 的质控

2.2 猪骨骼肌中 circRNA 的特征

2.3 circRNA 的差异表达

2.4 DE circRNA 来源基因的功能富集分析

2.5 潜在 circRNA/miRNA/mRNA 调控网络的构建

2.6 肌肉不同发育阶段 DE circRNA 的验证

3 讨论

4 小结

第三章 circLMO7 促进猪 SMSCs 增殖和分化

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.2 试验方法

2 结果与分析

2.1 circLMO7 鉴定及亚细胞定位

2.2 circLMO7 表达分析

2.3 circLMO7 过表达及干扰效率检测

2.4 circLMO7 促进猪 SMSCs 增殖

2.5 circLMO7 促进猪 SMSCs 成肌分化

3 讨论

4 小结

第四章 miR-145-5p 抑制猪 SMSCs 增殖与分化

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.2 试验方法

2 结果与分析

2.1 miR-145-5p的表达特性

2.2 过表达和抑制miR-145-5p效率检测

2.3 miR-145-5p 抑制猪 SMSCs 增殖

2.4 miR-145-5p 抑制猪 SMSCs 分化

3 讨论

4 小结

第五章 circLMO7/ miR-145-5p/IGF1R/AKT 促进猪 SMSCs 增殖与分化

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.2 试验方法

2 结果与分析

2.1 miR-145-5p 与 IGF1R 靶向关系的验证

2.2 circLMO7 与 miR-145-5p 及 IGF1R 和 AKT 通路靶向关系的验证

2.3 circLMO7 靶向 miR-145-5p/ IGF1R/AKT 促进猪 SMSCs 增殖与分化

3 讨论

4 小结

全文结论

创新与特色

参考文献

Abstract