旋毛虫成虫及肌幼虫期可溶性虫体蛋白对过敏性哮喘小鼠的干预

摘要

研究背景：
　　过敏性哮喘(Allergic asthma，AA)是一种慢性的气道疾病，系主要由嗜酸性粒细胞、肥大细胞和T淋巴细胞等多种炎症细胞共同参与的气道炎症性疾病。约占哮喘症的60％，其主要表现为气道的高反应性、气道炎症及黏液分泌量增加，患者反复发作胸闷、气促、喘息和(或)咳嗽等症状。在过去的几十年里，全球近3亿人患有过敏性哮喘，虽然可以自行缓解或者通过治疗缓解，但是对患者的健康和生活工作产生了极大的影响。随着现代社会经济及卫生条件的改善、各种抗生素的使用以及疫苗的接种，各种寄生虫、细菌、病毒的感染机率大大降低，哮喘的发病率呈明显升高的趋势。多年来，有学者认为都市化的生活环境降低了寄生虫和微生物的感染机会，导致人体的免疫刺激不足，这种情况下可能会引起免疫系统炎性因子不受控制的表达，甚至免疫系统发育的改变。一些研究发现，通过蠕虫感染可在一定程度上缓解过敏性哮喘。利用蠕虫治疗过敏性疾病已被大量的临床试验证实，但是利用活虫治疗过敏性疾病还存在着较大的争议，而利用蠕虫相关蛋白预防或治疗成为一种新的方式和途径，且具有潜在的临床应用价值。有文献报道，感染旋毛虫可诱导显著的Treg升高，从而抑制过敏性哮喘过度的Th2反应，且其不同时期(急性和慢性感染阶段)感染均可以显著缓解哮喘的相关症状，是否可以用旋毛虫不同时期的可溶性虫体蛋白(Soluble worm protein)来替代活虫感染对过敏性哮喘进行干预，进而对宿主的免疫系统进行调节，目前国内外尚无研究报道。本研究选用旋毛虫成虫期可溶性虫体蛋白(Soluble adult worm protein，SAP)及肌幼虫期可溶性虫体蛋白(Soluble muscle larvae protein，SMP)，探讨其对卵清白蛋白(Ovalbumin，OVA)诱导的BALB/c小鼠过敏性哮喘模型的影响，并对其作用机制进行初步研究。
　　目的：
　　1.观察旋毛虫成虫及肌幼虫期可溶性虫体蛋白对过敏性哮喘小鼠模型的影响。
　　2.探讨旋毛虫成虫及肌幼虫期可溶性虫体蛋白干预对过敏性哮喘模型小鼠产生的免疫调控机制。
　　方法：
　　1．通过OVA诱导成年BALB/c小鼠过敏性哮喘发作，建立小鼠过敏性哮喘模型。将24只小鼠随机均分为4组：对照组(PBS组)、哮喘组(PBS+OVA组)、成虫可溶性虫体蛋白治疗组(SAP+OVA组)、肌幼虫可溶性虫体蛋白治疗组(SMP+OVA组)。在致敏的同时，治疗组经腹腔分别注射成虫及肌幼虫期的可溶性虫体蛋白，蛋白量为100μg OVA抗原+200μg氢氧化铝[Al(OH)3]，而哮喘组注射等量的PBS；模型小鼠用滴鼻法激发，在激发的同时治疗组予以成虫及肌幼虫期可溶性虫体蛋白50μl，蛋白量为50μg，而哮喘组注射等量的PBS。
　　2．小鼠模型建立后，观察小鼠支气管哮喘的发病情况，末次激发48h后处死小鼠，肺泡灌洗后取肺脏进行病理切片， HE染色后观察肺部病理变化；肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid, BALF)离心后取沉淀涂片，吉姆萨染色观察嗜酸性粒细胞情况。
　　3．收集小鼠肺泡灌洗液，应用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞因子IL-4、IL-10、INF-γ、TGF-β水平。
　　结果：
　　1．过敏性哮喘模型小鼠肺组织病理切片显示，支气管周围存在大量的嗜酸性粒细胞及其他炎性细胞，肺泡灌洗液沉淀涂片也显示大量嗜酸性粒细胞及其他炎性细胞存在，肺泡灌洗液细胞因子检测也支持哮喘症状存在，证明支气管哮喘小鼠模型建立成功。
　　2．通过检测各组小鼠肺泡灌洗液中细胞因子IL-4、IL-10、IFN-γ、TGF-β的分泌水平发现，与OVA组比较，SAP及SMP治疗组IFN-γ分泌水平下降；IL-4水平和IL-10分泌水平下降；TGF-β分泌水平升高。
　　结论：
　　1.研究证实旋毛虫成虫及肌幼虫期可溶性虫体蛋白可缓解OVA诱导的过敏性哮喘小鼠的症状。
　　2.旋毛虫成虫及肌幼虫期可溶性虫体蛋白治疗后，各组小鼠哮喘症状缓解，表明成虫及肌幼虫可溶性虫体蛋白对小鼠的过敏性哮喘具有一定的免疫调控作用。

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前言

材 料 与 方 法

1 实验材料

1.1 实验动物

1.2 旋毛虫虫株

1.3 主要试剂

1.4 主要仪器和设备

2、实验方法

2.1旋毛虫成虫及肌幼虫虫体的获取

2.2 旋毛虫的保种

2.3 旋毛虫成虫及肌幼虫期可溶性虫体蛋白的制备

2.4 旋毛虫虫体蛋白浓度的测定

2.5 OVA诱导过敏性哮喘小鼠模型及蛋白治疗组的建立

2.6肺泡灌洗液的获取

2.7 双抗体夹心法(ELISA)技术检测肺泡罐洗液细胞因子IFN-γ 、TGF-β、IL-4、IL-10的步骤

3.统计学分析

4. 试验流程图

5.实验结果

5.1小鼠症状观察

5.2 肺泡灌洗液涂片细胞计数分析

5.3 肺组织病理切片

5.4 用双抗体夹心法(ELISA)检测试验小鼠肺泡灌洗液细胞因子

6. 小结

讨论

结论

参考文献

致谢

附录A 英文缩略词表

附录B 常用试剂配置

附录C 个人简历

附录D 已发表的论文

附录E 综述:蠕虫在过敏性哮喘中的作用