不同动物胆汁的成分差异分析及对非酒精性脂肪肝的作用研究

摘要

目的:
　　本文采用非酒精性脂肪肝大鼠模型，以熊胆粉、猪胆粉、牛胆粉和鸡胆粉为干预手段，比较不同动物胆汁粉对非酒精性脂肪性肝病的疗效，并对四种动物胆汁的生物活性成分进行质谱分析对比，以期对临床用药提供理论依据。
　　方法:
　　1:构建动物模型及给药干预:60只SPF级雄性SD大鼠，平均体重为200±10g，经过一周的适应性喂养，依据体重无差异原则(P＞0.05)随机分组:正常对照组大鼠10只、高脂饮食造模组大鼠50只。高脂饮食组又分为模型组10只、熊胆粉干预组10只、猪胆粉干预组10只、牛胆粉干预组10只和鸡胆粉干预组10只。自高脂饲料喂养第七周开始，每天除正常组及模型组使用等体积的生理盐水灌胃外，分别给不同组大鼠进行相对应的动物胆汁粉末干预，持续治疗4周。
　　2:实验动物取材:末次给药24小时，禁食8小时候，腹腔注射3％戊巴比妥钠60mg/kg麻醉，腹主动脉采血，处死，取肝脏，称重。3000转离心，使血清分离，-20℃保存，备用于血液生物化学指标;迅速分离整个肝脏，称重，取右叶肝组织1×1×1cm3，用4％多聚甲醛（以pH7.4的PBS配制）固定，用于形态学观察。
　　3:指标检测:跟踪并记载大鼠的一般情况，其中包括大鼠的日常活动度、每周称量大鼠体重、查看毛色、饮食量、尿液颜色等。使用全自动生化仪对大鼠血清中谷草转氨酶(glutamic oxalacetic transaminase，AST)、谷丙转氨酶(glutamate pyruvate transaminase，ALT)、甘油三酯(triglyceride，TG)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、高密度脂蛋白(high-density lipoprotein，HDLC)、低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDLC)、直接胆红素(direct bilirubin，DBIL)和总胆固醇(total cholesterol，CHOL)8个生化指标进行检测。取材时记录最终体重、肝脏状态和肝脏重量。HE染色观察肝脏的病理组织学变化。
　　4:HPLC-Q-TOF MS法成分分析:对熊胆粉、猪胆粉、牛胆粉和鸡胆粉进行成分分析，结果用保留时间、精确分子量和标准品比对，并用文献查找的方式，鉴定不同胆汁中的差异成分，结合四种胆汁粉末对非酒精性脂肪肝的功能差异，分析药效物质基础。
　　结果:
　　高脂饮食制备非酒精性脂肪肝模型会引起大鼠体重的明显增加（P＜0.01），不同动物胆汁干预对高脂饮食引起的体重增加有不同的影响。其中，熊胆粉、猪胆粉、牛胆粉能抑制非酒精性脂肪肝大鼠的体重增加（P＜0.05），而鸡胆汁干预对脂肪肝大鼠的体重没有影响（P＞0.05）;与空白对照组比较，模型组大鼠的肝脏重量有明显的升高（P＜0.01），而熊胆粉和猪胆粉干预对模型组大鼠的肝脏重量增加有抑制作用(P＜0.05)，熊胆粉效果更加显著(P＜0.01)，牛胆粉和鸡胆粉的干预对非酒精性脂肪肝大鼠的肝脏重量无影响（P＞0.05）。此外，牛、熊胆汁可有效缓解高脂饮食诱导的肝脏组织病理学损伤，如肝肿大、变色、肝细胞肿胀、脂滴空泡形成等，而猪胆汁和鸡胆汁未显示明显的治疗效果。另外，与正常组比较，模型组大鼠血液的肝功能指标均有显著的升高，包括AST、ALT、TG、DBIL、ALP、LDLC和CHOL，不同动物胆汁干预能不同程度抑制其生化指标的升高。特别是熊胆汁对非酒精性脂肪肝引起的生化指标异常改变的疗效尤为突出。本研究通过HPLC-Q-TOF MS技术对不同胆汁的生物活性成分分析发现，在不同类型的动物胆汁中，以胆酸、牛磺去氧胆酸和去氧胆酸三个成分为例，其相对含量存在显著差异。同时，我们在熊胆粉中检测到一种独特的成分，其分子量为496.2738Da，其功能尚未见报道。
　　结论:
　　本研究结果表明熊、猪、牛、鸡四种动物的胆汁粉末对高脂饮食引起的非酒精性脂肪肝均有不同的治疗效果，熊胆粉的综合疗效最为显著;同时，不同类型动物胆汁的生物活性成分不同，这可能是熊、牛、猪或鸡胆汁对非酒精性脂肪肝治疗效果不同的原因。而仅在熊胆粉中发现的一种496.2738Da的化合物，可能为其未知的有效成分，为熊胆粉治疗非酒精性脂肪肝未来的研究提供了新的思路。

目录

声明

摘要

英文缩略词表

引言

第一部分：不同动物胆汁粉末对非酒精性脂肪肝的影响

实验材料与方法

1 材料与仪器

2 大鼠脂肪肝动物模型的制备

3 给药方法

4 标本采集

5 实验内容

6 生化指标检测

7 统计学分析

实验结果

8 预实验：模型确定

9 行为学观察

10 不同动物胆汁粉末对模型大鼠体重的影响

11 不同动物胆汁粉末对模型大鼠肝脏的影响

第二部分：HPLC-Q-TOF方法分析不同动物胆汁粉末的化学成分的定性研究

实验材料与方法

1 材料与仪器

2 实验方法

3 高效液相色谱条件的优化

4 不同动物胆汁成分的差异分析

5 小结

讨论

结论

不足之处与展望

参考文献

文献综述 熊胆的药理作用研究进展

致谢

作者简历