人抗凝血酶Ⅲ基因转染血管内皮样细胞并表达的实验研究

摘要

第一部分人骨髓间充质干细胞定向诱导分化为血管内皮样细胞的实验研究 [目的] 本研究拟通过体外分离和纯化成人骨髓间充质干细胞，体外定向诱导分化为血管内皮样细胞，探讨为组织工程血管的构建提供内皮细胞种子细胞的可能性。 [方法] 1、成人骨髓间充质干细胞的分离、培养和扩增： 收集骨髓血，采用密度梯度离心+贴壁培养法提取单个核细胞进行体外培养扩增。 2、定向诱导间充质干细胞向内皮样细胞分化：用含10n咖1 VEGF培养液诱导细胞，连续诱导观察11天。 [结果] 1、间充质干细胞特性本实验分析了5个标本，每个标本体外扩增10代可获细胞数为8×10<'10>个左右；细胞高表达CD105、CD29和CD44，弱表达KDR。 2、诱导间充质干细胞向内皮样细胞定向分化诱导14天后细胞vwF强阳性表达；接近融合细胞外观呈现为特征性的鹅卵石样形态；透射电镜显示胞质内可见大量的吞饮小泡：将诱导后14天细胞接种在细胞外基质凝胶(ECMgel)中可形成毛细血管样结构。 [结论] 1、采用密度梯度离心+贴壁培养法，可以获得足够量较为单一、具有较强增殖能力的间充质干细胞。 2、问充质干细胞可以在体外定向分化为具有内皮细胞特性的细胞，可以作为组织工程化血管内皮细胞的种子细胞来源。 第二部分人骨髓间充质干细胞来源的血管内皮样细胞与人脐静脉来源的血管内皮细胞主要抗凝基因表达对比的实验研究 [目的]观察不同来源的血管内皮细胞抗凝能力的差异。 [方法] 1、采用密度梯度离心及贴壁培养法对人骨髓间充质干细胞(BMMSCs)进行体外培养、纯化和扩增，用含有VEGF(10ng/ml)的诱导培养液对其进行体外诱导分化产生血管内皮样细胞； 2、采用胶原酶消化法获取和体外培养人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)； 3、用RT-PCR法检测BMMSCs来源的血管内皮样细胞及HuVECs的主要抗凝血基因(组织纤溶酶原激活物、组织因子途径抑制因子、抗凝血酶Ⅲ及内皮型一氧化氮合酶)mRNA的表达。 [结果] 1、BMMSCs能够在体外成功诱导分化为血管内皮样细胞，但不表达主要抗凝基因的mRNA； 2、 HUVECs能够表达这些基因的mRNA。 [结论] BMMsCs能够成功诱导分化为血管内皮样细胞，但它的抗凝能力较HUVECs弱。 第三部分人抗凝血酶III基因转染血管内皮样细胞并表达的实验研究 [目的] 将人抗凝血酶Ⅲ(hAT-Ⅲ)基因导入由BMMSCs诱导产生的血管内皮样细胞(VELCs)，并观察它的表达情况，为提高组织工程化血管抗血栓能力的基因治疗提供实验基础。 [方法] 1、采用脂质介导的DNA转染方法将含有hAT-Ⅲ基因的质粒DNA pBLAST49-hAT3导入由BMMSCs诱导产生的VELCs； 2、对转染后的VELCs进行RT-PCR、免疫组化、Westen-Blot以及AT-Ⅲ的活性检测，观察hAT-Ⅲ的表达情况。 [结果] 1、RT-PCR检测显示，转染后第72、96 h的VELCs能够表达hAT-Ⅲ基因的mRNA； 2、免疫组化染色显示，转染后第72、96 h的VELCs阳性表达AT-Ⅲ； 3、Westen-Blot检测显示，转染后第72、96 h的VELCs细胞培养上清液阳性表达AT-Ⅲ： 4、活性检测显示，转染后第72、96 h的VELCs细胞培养上清液有AT-Ⅲ低活性。 [结论] 1、采用脂质介导的方法可以成功将质粒pBLAST49-hATⅢ转染血管内皮样细胞，并且转染后的血管内皮样细胞可以对AT-Ⅲ基因进行表达； 2、可以通过对血管内皮样细胞进行基因修饰，从而提高它的抗血栓形成能力。

目录

论文说明：英文缩略词对照表

序言

第一部分人骨髓间充质干细胞定向诱导分化为血管内皮样细胞的实验研究

一、材料和方法

二、实验结果

三、讨论

四、结论

第二部分人骨髓间充质干细胞来源的血管内皮样细胞与人脐静脉来源的血管内皮细胞主要抗凝基因表达对比的实验研究

一、材料和方法

二、实验结果

三、讨论

四、结论

第三部分人抗凝血酶Ⅲ基因转染血管内皮样细胞并进行表达的实验研究

一、材料和方法

二、实验结果

三、讨论

四、结论

结语

参考文献

文献综述： 体外构建组织工程化血管的研究现状

致谢