一种在人工血管内表面种植内皮/内皮样细胞的方法

摘要

本发明提供了一种在人工血管内表面种植内皮/内皮样细胞的方法，采用生物力学的方法，通过体外的脉动的、阶梯式增加的流体剪应力作用，使内皮细胞更好地粘附在人工血管内壁，使粘附在人工血管内壁上的内皮细胞预先适应流体剪应力的作用，使得它在血管移植入体内后有更好的耐受血流剪应力作用的能力。利用该方法可以在各种材料来源的人工血管表面种植内皮细胞，包括合成生物材料、天然生物材料，制备人工血管。

说明书

技术领域

本发明涉及一种在人工血管内表面种植内皮/内皮样细胞的方法。

背景技术

心血管系统疾病是世界上发病率最高的疾病之一，也是目前占主导地位的死亡原因，其主要的治疗手段就是血管移植术。每一年仅在美国就要进行超过570,000的冠状动脉旁路血管移植手术，另外血管旁路手术的实施也需要大量的外周血管的移植。由此导致了对小口径(＜6mm)血管移植物的大量需求。

而血管组织工程学的目的就是在体外构建理想的血管移植物，移植后无免疫排斥反应，能维持移植血管腔的长期通畅。心血管外科需要各种直径大小的血管移植物作为修补材料。目前直径＞6mm的人工血管移植物已经广泛应用于临床，而小口径人工血管移植物大量需求的同时又因阻塞率较高，临床应用明显受到限制。因此导致目前血管组织工程的热点在于制备管径小于6mm的小血管。小血管移植失败的原因，在急性期主要为血栓形成；在慢性期主要为平滑肌细胞向移植物管腔内增生和吻合处血管翳的形成导致管腔阻塞。相对于组织工程血管而言，人体自身血管由于有血管内皮细胞的屏障作用，具有良好的抗血栓形成能力。因此，使人工血管材料成功内皮化是提高小口径人工血管通畅率的希望所在。

1、在人工血管内表面接种内皮/内皮样细胞

通过对血管内皮细胞(VEC)的研究，发现VEC具有高度代谢活性并有内分泌的功能，它能合成和释放多种生理有效物质，对许多生理活动有调节作用，维持体内生理活动的平衡，诸如对血管平滑肌张力、微血管通透性、血小板活性、凝血、抗凝血及纤溶系统等方面的调节。VEC表面同血细胞一样带有负电荷，能阻止血细胞在人造血管腔上的沉积，因此VEC的种植具有抗血小板聚集、防止血液凝固和血栓形成的作用。

1970年由Mansfield首先提出内皮细胞的种植方法，近年众多的研究者也在尝试通过内皮细胞衬里来改善移植物的性能，使移植物能在体内具有更好的仿生能力。1998年，ShinokaT等设计制作了体外自体肺动脉移植血管。取出生后20天的绵羊的颈动脉，采用组织块培养方法获得混和细胞群落，再应用荧光标记法分离平滑肌细胞(SMCs)和内皮细胞(ECs)，先后种植于可吸收材料聚乳酸-共乙醇酸(PGLA)上，7天后用体外构建的血管置换原绵羊主肺动脉。移植10～12周后，无明显血栓形成和钙化的迹象，这一工作开创了新型血管移植物研究的先河(Shinoka T，Tim AD，etal.Creation of viable pulmonary artery autograftsthrough tissue engineering.J Thorac Cardiovasc Surg.1998，115：536-546。题目为：采用组织工程方法开发活的肺动脉自体移植物)。

近来陆续有关于自体EC移植促进损伤内皮修复的报道。Conte等使用兔股动脉球囊损伤模型，阻断股动脉两端血流后，将转染β-半乳糖苷酶基因的自体颈静脉EC注入内皮剥脱血管段，发现自体颈静脉EC移植能有效抑制高胆固醇血症兔球囊成形术后再狭窄。Darcin等运用狗股动脉球囊损伤模型，将自体颈静脉EC移植到内皮剥脱血管段，实验结果显示此种方法也能明显改善损伤血管的长期通畅率。

虽然组织工程血管移植物内皮化后在一定程度上改善了血栓形成问题，但是仍然没有解决小口径血管的远期通畅率问题。研究发现对于口径小于6mm的血管移植物EC的低灌注量导致了内皮细胞在移植物上粘附力不够，从而产生了远期通畅率都比较低的后果，因此在衬里技术方面还要进一步改善。早在1994年Herring就指出在膨体聚四氟乙烯(ePTFE)支架材料上种植内皮细胞使支架内皮化的失败，与内膜增生和内腔面血栓的形成相关联，并指出其可能的原因就是支架材料植入体内后材料内腔面的内皮细胞层的缺失。Bhat VD等认为其机制可能就是体内的血液流动减弱了植入体内的细胞的粘附力，使植入的内皮细胞脱落，因此如何提高接种后内皮细胞的粘附能力又成为急需解决的问题。

2、提高内皮/内皮样细胞在血管壁上的粘附性

人工血管能否内皮化，取决于种植细胞在人工血管壁上粘附、生长和扩展的能力。一方面可以通过高密度种植内皮细胞，在血管移植物内表面形成一层牢固的融合细胞。另一方面则要保证移植物植入体内后，种植细胞在血流作用下仍能附着于管壁上。研究者发现体外粘附于移植物上的VEC在体内剪应力场中很容易脱落，即发现内皮细胞粘附不牢固，组织工程血管的远期通畅和血栓形成的问题仍然没有得到解决，由此提出了各种提高EC在移植物表面粘附力的方法，主要有：

(1)在人工血管壁上预衬细胞外基质(ECM)蛋白：如纤维连接蛋白(fibronectin，FN)、纤维蛋白原(fibrinogen，FG)、玻璃体连接蛋白(vitronectin，VN)、层粘连蛋白(laminin，La)和胶原蛋白(collagen，CL)等。FN、FG和VN结构中排列的精氨酸-甘氨酸—天门冬氨酸—丝氨酸(RGDs)为主要的细胞粘附决定簇。RGDs具有特异性识别功能，可与内皮细胞膜上一个跨膜的蛋白家族——整合素家族(Integrinsfamily，IF)特异结合，从而能粘附内皮细胞。鉴于此，一些研究小组直接在人工血管壁上附以RGD肽链加以修饰，或者在人工血管壁上固定包含RGD的多肽，可促进内皮细胞的粘附。

(2)利用生物素(biotin)与抗生物素蛋白(avidin)的特异结合力而增加内皮细胞的粘附：将培养的内皮细胞经生物素处理，而在人工血管内壁衬以抗生物素蛋白，利用他们的特异亲合力，可以明显增强内皮细胞在人工血管壁上的粘附与抗切应力的能力。

(3)利用细胞生长因子的作用，提高内皮细胞的粘附与生长能力：如利用成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)与肝素有高亲合力位点，而肝素的缓慢释放可以抑制平滑肌增殖的特点，在肝素—白蛋白预衬的人工血管壁中加入FGF，也有助于内皮细胞的生长和粘附。

(4)改变植入内皮细胞的带电性：由于内皮细胞带负电，而人工血管壁(如ePTFE)也带负电，相互间具有排斥作用。可以利用静电作用使植入的内皮细胞带上短时间的正电或少带负电，从而提高内皮细胞在血管壁上的附着能力和抗血流切应力的能力。但负电荷减少的同时又增加了血栓形成的机率。

(5)应用分子生物学技术：现代分子生物学技术的发展，使人们可能对细胞基因进行修饰。因此，在接种的内皮细胞里导入致血管扩张、抗血栓形成的基因片段，就有希望从根本上提高人工血管的通畅率。

(6)内皮细胞与平滑肌细胞的联合培养：平滑肌细胞(SMC)是血管壁的主要细胞成分。此种细胞能产生多量细胞外基质成分，SMC通过直接或间接的方式影响内皮细胞的形态，从而有利于内皮细胞的附着。

虽然研究者们采用了各种方法来提高内皮细胞的粘附性，但是在血管移植物植入体内后，在长期的血液流场中仍然易发生内皮细胞层的脱落，从而导致血栓的形成。经过长期的探索，人们逐渐认识到内皮细胞是保持血管稳定性的天然调节物。在血管损伤后，血管的内皮细胞单层具有抗血栓形成和平滑肌细胞增生的作用。Shannon L等人指出成功的组织工程血管移植物必须要保证有能够抵抗血流剪切力和血栓形成的内皮细胞单层(Shannon L，Niklason MLE..Requirements for growing tissue-engineered vascular grafts.Cardiovascular Pathology.2003，12：59-64。题目为：对活的组织工程血管移植物的需求)。

3、流体力学环境对血管内皮细胞的影响：

现已知，构建组织工程血管的一大难题在于血管处在一个天然的机械动力环境，它包括：血液流经内皮层的切线作用产生的剪切力(shear stress)，环形管壁舒缩产生的牵张应力(stretch stress)和静水压产生的正常应力。剪切力对血管内皮细胞的形态、增殖、极性及基质的构成和结构有着重要的影响。

(1)剪切力对内皮细胞(EC)形态的影响：很早以前，人们就注意到在体内条件下血流可影响ECs的形态和排列方向。在单向稳定的高切应力区域ECs呈长梭形，细胞长轴与切应力方向一致。而在低切应力或血液滞留区域，ECs呈圆形，细胞的排列没有定向。体外实验发现人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)被38、75dyne/cm²的流体剪切力作用12小时后，内皮细胞被拉长，长轴与流场方向一致，且内皮细胞的拉长，定向程度与切应力大小、作用时间长短有关(陈槐卿.医用生物力学.2003，18(增刊)：3-4.)。最近的研究也证明了无论在体内还是在体外，血流剪切作用内皮细胞，将刺激内皮细胞释放前列环素(Prostacyclin，PGI₂)和内皮细胞衍生舒张因子(Endothelium-derived relaxing factor，EDRF)。静态的呈现多边形的内皮细胞直接在血流剪切力作用下逐渐变得细长和定向于流动方向。内皮细胞的形态因切应力的作用而发生的形态重建(腔面呈现流线型的特征)，有助于降低血液流动对内皮细胞的牵拉作用，从而保持内皮细胞单层结构的完整性。

(2)剪切力对内皮细胞粘附力的影响：研究显示剪切力条件可以提高其作用下细胞的粘附能力，在流动条件下，剪切力逐渐加载于内皮细胞衬里的材料支架，实验发现剪切力的作用促进了细胞支架网络的重建和细胞基底粘附。内径为1.5mm的聚氨酯(polyurethane，Pu)血管种植了EC，通过1-2dyn/cm²的剪切力作用3天，然后再用25dyn/cm²的剪切力再继续作用3天，实验后研究者发现保存了较完整的内皮细胞层，而直接用25dyn/cm²的剪切力作用后只有少量的内皮细胞的存留(Ott MJ，Ballermann BJ.Shear stress-conditioned，endothelial cell-seeded vascular grafts：Improved cell adherence in response to invitro shear stress.Surgery.1995，117：334-339。题目为：剪应力驯化的接种了内皮细胞的血管移植物：体外剪应力的作用增加了细胞粘附)(Dardik A，Liu A，Ballermann B.Chronic in vitro shear stress stimulates endothelial cell retention on prostheticvascular grafts and reduces subsequent in vito neointimal thickness.Journal ofVascular Surgery.1999，29(1)：157-167。题目为：长期的体外剪应力作用增加了内皮细胞在人工血管移植物上的滞留率，之后减少了体内新生内膜的厚度)。内径为4mm的绵羊颈动脉(Photofix)，通过研究者们控制的剪应力的作用，使得在剪应力值初始值为约0.25dyn/cm²，最终为约1.2dyn/cm²时，作用时间为6小时，内皮细胞在Photofix上的保留面积为50％(Carnagey J，Anderson DH，Ranieri J，et al.Rapid endothelialization ofphotofix natural biomaterial vascular grafts.J Biomed Mater Res Part B：ApplBiomater.2003，65B：.171-179。题目为：photofix天然人工血管的快速内皮化)。虽然这些研究中前者采取的剪应力值有一定的随意性，而且采用的剪应力值的个数很有限，仅包含了1或25dyn/cm²，后者选取的剪应力值很小，与人体正常的剪应力值有较大差异，但是他们的结果暗示了逐渐增加的剪切力能够提高细胞耐受(抵抗)生理水平的流动力。在本发明中采取的是阶梯式(stepwise)的增加的剪应力，更强调剪应力的逐渐增加过程，而涉及到的剪应力值是处于正常人体血管内皮细胞所受的剪应力值范围，研究结果也证实，采用本发明方法使得接种在去除内皮细胞的Wistar大鼠颈动脉上的人脐静脉内皮细胞通过阶梯式增加的，最终高达26dyn/cm²的剪应力作用24小时后，其保留面积为80％以上。2002年李玉泉等报道了40dyn/cm²的稳定层流切应力下，与平滑肌联合培养的内皮细胞的ECM中纤维连接素(fibronectin，Fn)和层粘连蛋白(laminin，Ln)的含量增多，而导致了内皮细胞的粘附能力和抗流体剪应力能力增加。Philippe等人在实验中使用聚乙二醇对苯二甲酸酯(polyethyleneterephthalate，PET)血管(内径6mm)，并在内腔面涂布牛胶原和低密度肝素，采用脉动灌注系统培养粘附在移植物上细胞，实验结果也显示长期的灌注和高水平(与血流剪切力相等)的剪切力十分有利于种植内皮细胞的在移植物上的存留。

(3)剪切力对内皮细胞应力纤维形成的影响：剪切力引起的EC的重排与EC细胞骨架的变化密切相关。细胞骨架由微丝、微管、中间纤维组成，其中肌动蛋白微丝(主要由纤维状肌动蛋白，F-actin组成)研究较多。陈槐卿在实验中除了发现流体剪切力作用的内皮细胞的被拉长，与流场方向一致外，同时也观察到了细胞内F-actin的排列方向也与切应力方向一致。早在1984年，Franke等就已经发现将培养的单层HUVEC在2dyne/cm²剪切力作用下，2-3小时后细胞中央形成了应力纤维，但是增加应力作用时间后，应力纤维无明显增加，细胞的形态仍然保持多角形。Dewey等也发现8dyne/cm²剪切力作用24h后内皮细胞中出现了应力纤维，此时的细胞形态也没有改变。我们的研究发现在流动状态下，培养的单层内皮细胞经10dyne/cm²作用24h后，细胞中央出现微丝形成的应力纤维，这一结果也说明了剪切力有诱导内皮细胞应力纤维形成的作用。在这些研究中，应力纤维虽然已经形成，但只是数量的增加，尚未形成粗大的微丝，这可能与切应力水平较低有关，我们通过增加剪切力的水平和长作用时间，发现细胞中央出现了非常显著的束状应力纤维，微丝的长度、厚度等都有明显的增加。这些实验说明了应力纤维的形成和增加的程度依赖于剪切力的大小和作用时间，也说明了在组织构建过程中需要用高水平和相对长时间的作用力来进行内皮细胞的动态培养。

(4)剪切力对内皮细胞增殖的影响：研究者(Brian S.Conklin，M.S，et al.Shear StressRegulates Occludin and VEGF Expression in Porcine Arterial Endothelial Cells.Journal of Surgical Research.2002，102：13-21。题目为：剪应力调节了猪动脉内皮细胞的跨膜紧密连接蛋白和血管内皮细胞生长因子的表达)应用血管移植物灌流培养系统(15dyn/cm²和1.5dyn/cm²)为体外血管移植物(取自猪颈动脉)提供了生理条件下的压力和流动状态，使内皮细胞和平滑肌细胞得到了长期的存活。研究证明了低剪切力导致内皮细胞的增殖，上调内皮细胞VEGF的表达，而VEGF也促进内皮细胞增殖。

(5)剪切力对内皮细胞生理活性的影响：在分子生物学水平上，切变应力可上调c-fos，c-jun，c-myc等原癌基因mRNA水平，其基因产物作为转录激活因子或抑制因子结合于DNA启动子上的转录位点，调节基因表达。同时，切变应力可调节内皮素-1、组织纤溶酶原激活物(tPA)、血小板源性生长因子(PDGF)、粘附因子等目标基因mRNA水平。这些基因的表达产物对于重塑血管，调节细胞间、细胞和基质间的特异性吸附有重要作用。这些情况与体外静态培养的内皮细胞间存在着巨大的差异。高水平的剪切力还促进了内皮细胞释放细胞因子，这些因子能抑制凝血、白细胞的迁移和平滑肌细胞的增殖，而低水平的剪切力则起到了相反的作用。

发明内容

为了促进接种在人工血管内壁的内皮细胞粘附、为了提供粘附后内皮细胞耐受血流剪应力作用的能力，本发明提出一种在人工血管内表面种植内皮/内皮样细胞的方法，即采用生物力学的方法，通过体外的脉动的、阶梯式增加的流体剪应力作用，使内皮细胞更好地粘附在人工血管内壁，使粘附在人工血管内壁上的内皮细胞预先适应流体剪应力的作用，使得它在血管移植入体内后有更好的耐受血流剪应力作用的能力。

为达到上述目的，本发明采用了以下两种方法：方法一，在收集内皮细胞成细胞悬液后，接种在人工血管内表面，静态培养至细胞在人工血管内表面成融合状态后，施加脉动的、阶梯式增加的流体剪应力，直至达到在体时内皮细胞所受的剪应力值。在接种过程中，人工血管绕着其中轴线以一定的角速度转动。方法二，在收集内皮细胞成细胞悬液后，接种在人工血管内表面，同时开始施加脉动的、阶梯式增加的流体剪应力，直至达到在体时内皮细胞所受的剪应力值。在接种过程中，人工血管绕着其中轴线以一定的角速度转动。

本发明中的人工血管可以为合成生物材料的，如涤纶(Dacron)、膨体聚四氟乙烯(e-PTFE)、聚氨酯(polyurethane，Pu)等，可以为天然生物材料的，如小肠粘膜下层、心包膜、筋膜、血管、或真皮等制成的无细胞基质。

本发明方法的优点是通过脉动的、阶梯式增加的流体剪应力的作用，与现有的技术相比，本发明更强调流体剪应力的阶梯式加载过程，具有较匀速和逐渐增加的特点，之后，在达到在体所要求承受的剪应力值后，维持该值，直至进行动物实验等应用时才停止，剪应力的提供时间较长；所施加的剪应力是脉动的，接近于生理情况；而且本发明中涉及到的剪应力值范围处于正常人体的内皮细胞耐受范围，这样使得本发明方法制备人工血管具有潜在的临床应用价值；此外，本发明采用的内皮细胞可以是经过流体剪应力的驯化的，它在人工血管材料上具有更好的粘附性，这一点其他的研究者们是没有提到的。这样致使本发明在下列方面具有更大的优势：①使接种在人工血管内表面的内皮/内皮样细胞的细胞形态和排列情况接近于在体时的情况，即细胞伸长，顺流体方向排列；②增加内皮细胞在人工血管表面的粘附能力，从而使得人工血管在移植入体内后，能经受得了在体的血流剪应力的冲刷作用，而不致脱落；③诱导内皮/内皮样细胞应力纤维的形成；④抑制体外培养过程中内皮/内皮样细胞的过分增殖，使接种在人工血管内表面呈融合状态的内皮/内皮样细胞处于在体时的收缩表型；⑤使接种在人工血管内表面呈融合状态的内皮/内皮样细胞具有近似于在体的生理活性。这样达到对内皮细胞的逐渐驯化而增加其粘附性和生理活性的效果。

采用本发明方法使得接种在去除内皮细胞的Wistar大鼠颈动脉上的人脐静脉内皮细胞通过最终高达26dyn/cm²的阶梯式增加的剪应力作用24小时后，其保留面积为80％以上。而在同样的实验条件下，采用15dyn/cm²的作用经2小时后，细胞之间出现明显的空缺区，其保留面积小于50％。

图1接种在去除内皮细胞的Wistar大鼠颈动脉上的人脐静脉内皮细胞通过阶梯式增加的剪应力作用，剪应力从10dyn/cm²开始，阶梯为每3小时增加2dyn/cm²，脉动频率为40Hz，最终达到高达26dyn/cm²，血管绕其中轴旋转的速度为每小时120°，作用24小时后经过银染，在Olymus显微镜下的照片，放大倍数为80倍。照片中有较深颜色的线是细胞的膜被银染而成的，因此它表现的是细胞的轮廓，从照片中可以看出，细胞之间排列紧密。

图2接种在去除内皮细胞的Wistar大鼠颈动脉上的人脐静脉内皮细胞通过15dyn/cm²的剪应力作用2小时后经过银染，在Olymus显微镜下的照片，放大倍数为40倍。照片中有较深颜色的是细胞被银染而成的，从照片中可以看出，细胞之间有明显的空缺区。

附图说明

图1是通过本方法接种在去除内皮细胞的Wistar大鼠颈动脉上的人脐静脉内皮细胞的显微照片；

图2是接种在去除内皮细胞的Wistar大鼠颈动脉上的人脐静脉内皮细胞通过15dyn/cm²的剪应力作用2小时后经过银染，在Olymus显微镜下的照片。

具体实施方式

例1、在去除细胞基质的鼠颈动脉血管移植材料上静态接种，之后施加阶梯式增加的流体剪

应力，同时血管绕其中轴旋转培养内皮细胞

取经冷冻法去除内皮细胞的Wistar大鼠颈动脉，接种经过10dyns/cm²的剪应力驯化的兔原代动脉内皮细胞于内膜，接种方法如下：将经冷冻法去除内皮细胞的鼠颈动脉，内膜用PBS液清洗3次，将培养的原代兔内皮细胞用0.1％胰酶消化，收集细胞，细胞浓度约1×10⁶cells/cm²，将收集的细胞接种到血管内膜，37℃，5％CO₂培养箱静态培养约3天，待细胞融合成单层，然后，对接种的内皮细胞施加阶梯式增加的流体剪应力进行“驯化”，加载剪应力从10dyns/cm²开始，直至40dyns/cm²，阶梯为每隔3h增加5dyns/cm²，所需时间约12h，然后维持40dyns/cm²的剪应力，加载同时将人工血管以每半小时90°的角速度绕着其中轴线旋转，在37℃、5％CO₂培养箱中培养。由此得到该发明的血管移植材料。

例2、在去除细胞基质的鼠颈动脉血管移植材料上接种并同时施加阶梯式增加的流体剪应力，同时血管绕其中轴旋转培养内皮细胞

取经冷冻法去除内皮细胞的Wistar大鼠颈动脉，接种兔原代动脉内皮细胞于内膜，接种方法如下：将经冷冻法去除内皮细胞的鼠颈动脉，内膜用PBS液清洗3次，将培养的原代兔内皮细胞用0.1％胰酶消化，收集细胞，细胞浓度约1×10⁶cells/cm²，将收集的细胞接种到血管内膜，同时对内皮细胞施加阶梯式增加的流体剪应力，加载剪应力起始值约为5dyns/cm²，阶梯为每隔1h增加0.1dyns/cm²，所需时间约12h，再变化阶梯为每隔1h增加1.0dyns/cm²加载时间约12h，加载同时将人工血管以每半小时90°的角速度绕着其中轴线旋转，在37℃、5％CO₂培养箱中培养。由此得到该发明的血管移植材料。

例3、在去除细胞基质的山羊颈动脉血管移植材料上接种并同时施加脉动的、阶梯式增加的流体剪应力，同时血管绕其中轴旋转培养内皮细胞

取经酶消化法去除内皮细胞的山羊颈动脉，接种原代培养的人脐静脉内皮细胞于内膜，接种方法如下：取经酶消化法去除内皮细胞的山羊颈动脉，内膜用PBS液清洗3次，将培养的原代人脐静脉内皮细胞用0.1％胰酶消化，收集细胞，细胞浓度约1×10⁶cells/cm²，将收集的细胞接种到血管内膜，同时对内皮细胞施加脉动的、阶梯式增加的流体剪应力，脉动频率为80Hz，加载剪应力起始值约为5dyns/cm²，阶梯为每隔1h增加0.3dyns/cm²，所需时间约12h，再变化阶梯为每隔1h增加10dyns/cm²，加载时间约4h，之后维持约50dyns/cm²的剪应力，加载同时将人工血管以每分钟20°的角速度绕着其中轴线旋转，在37℃、5％CO₂培养箱中培养。由此得到该发明的血管移植材料。

例4、在膨体聚四氟乙烯(ePTFE)血管材料上静态接种，之后施加脉动的、阶梯式增加的流体剪应力，同时血管绕其中轴旋转培养的内皮细胞

将膨体聚四氟乙烯(ePTFE)血管支架材料灭菌处理后，取一段(内径约1.5mm，长约4-5cm)，接种经5-10dyns/cm²流体剪应力驯化的兔原代动脉内皮细胞于内膜，接种方法如下：将膨体聚四氟乙烯(ePTFE)血管支架材料的内膜用PBS液清洗3次，并预衬纤维粘连蛋白(FN)后，将培养的原代兔内皮细胞用0.1％胰酶消化，收集细胞，细胞浓度约1×10⁶cells/cm²，将收集的细胞接种到血管内膜，37℃，5％CO₂培养箱静态培养约3天，待细胞融合成单层后，施加脉动的、阶梯式增加的流体剪应力进行“驯化”，脉动频率为150Hz，加载剪应力从2dyns/cm²开始，直至20dyns/cm²，阶梯为每隔1h增加ldyns/cm²，所需时间约18h，然后维持20dyns/cm²的剪应力，加载同时将人工血管以每小时300°的角速度绕着其中轴线旋转，在37℃、5％CO₂培养箱中培养。由此得到该发明的血管移植材料。

例5、在聚氨酯(polyurethane，Pu)血管材料上接种并同时施加脉动的、阶梯式增加的流体剪应力，同时血管绕其中轴旋转培养内皮细胞

将聚氨酯(polyurethane，Pu)血管材料灭菌处理后，取一段(内径约2mm，长约4-5cm)，接种经5-10dyns/cm²流体剪应力驯化的人原代动脉内皮细胞于内膜，接种方法如下：将经聚氨酯血管支架材料的内膜用PBS液清洗3次，并预衬玻璃粘连蛋白(LN)后，将培养的原代人脐静脉内皮细胞用0.1％胰酶消化，收集细胞，细胞浓度约1×10⁶cells/cm²，将收集的细胞接种到血管内膜，同时对内皮细胞施加脉动的、阶梯式增加的流体剪应力，脉动频率为40Hz，加载剪应力起始值约为2dyns/cm²，阶梯为每隔1h增加0.2dyns/cm²，所需时间约12h，再变化阶梯为每隔1h增加5dyns/cm²，加载时间约5h，之后维持约35dyns/cm²的剪应力，加载同时将人工血管以每分钟10°的角速度绕着其中轴线旋转，在37℃、5％CO₂培养箱中培养。由此得到该发明的血管移植材料。

例6、在去除细胞基质的山羊颈动脉血管移植材料上接种并同时施加脉动的、阶梯式增加的流体剪应力，同时血管绕其中轴旋转培养内皮细胞

取经酶消化法去除内皮细胞的山羊颈动脉，接种原代培养的人脐静脉内皮细胞于内膜，接种方法如下：将经酶消化法去除内皮细胞的山羊颈动脉血管移植材料内膜用PBS液清洗3次，将培养的原代人脐静脉内皮细胞用0.1％胰酶消化，收集细胞，细胞浓度约1×10⁶cells/cm²，将收集的细胞接种到血管内膜，同时对内皮细胞施加脉动的、阶梯式增加的流体剪应力，脉动频率为60Hz，加载剪应力起始值约为10dyns/cm²，阶梯为每隔1h增加0.3dyns/cm²，所需时间约12h，再变化阶梯为每隔1h增加3dyns/cm²，加载时间约10h，之后维持约45dyns/cm²的剪应力，加载同时将人工血管以每分钟5°的角速度绕着其中轴线旋转，在37℃、5％CO₂培养箱中培养。由此得到该发明的血管移植材料。