抗CD3/抗Pgp微型双功能抗体的改造及活性研究

摘要

肿瘤细胞对不同的化学相关或不相关的抗肿瘤药物产生不敏感性，即多药耐药(Multidrug resistance，MDR)。MDR是造成肿瘤化疗失败的主要原因，产生MDR的原因通常是因为药物失活或被外排泵排出肿瘤细胞。MDR产生的主要分子机制是细胞表面存在一种叫做P—糖蛋白(P—glycoprotein，Pgp)的跨膜糖蛋白，由MDR1基因编码，Mr为170000。Pgp蛋白属于ATP结合盒(ATP—binding cassette，ABC)转运蛋白超家族，是ATP依赖性的药物外排泵，能将各种不同的药物排出细胞，从而产生MDR。已经证实Pgp蛋白与肿瘤复发和预后差高度相关，是评价肿瘤预后的重要指标之一。以Pgp为治疗靶点已经成为克服肿瘤耐药的新策略。 Diabody是双特异性抗体(Bispecific antibody)的一种构建形式之一。通常是两个具有不同抗原结合位点的抗体可变区序列，在同一个启动子控制下组成两个顺反子，同一顺反子中VH和VL用一个短Linker连接。表达产物中同一顺反子上的VH和VL因Linker太短而存在空间位阻，不能配对，只能与另一顺反子上的VH和VL配对，共价结合形成二聚体。Diabody分子量在55—60 kDa，肿瘤穿透性强；缺乏Fc段，副作用小；Diabody能够将体内细胞毒性T细胞靶向到肿瘤细胞表面，直接发挥细胞毒杀伤效应，避免了使用外源性非特异性细胞毒性物质，并且不受MHC限制。抗CD3/抗Pgp Diabdoy具有良好的临床应用前景。但是，由于Diabody自身结构特点，两条肽链是通过非共价键结合在一起，容易解离而失去活性。向Diabody引入二硫键，可以大大增强其稳定性，并且不影响抗体亲和力，甚至亲和力增加。 T细胞活化需要协同刺激信号，否则，T细胞不但不能有效活化，还会处于无能状态。B7分子是协同刺激分子最主要的家庭成员，它包括两种分子：CD80和CD86。文献报道，化疗药物阿糖胞苷(ARA—C)能够诱导肿瘤细胞高表达B7分子。因此，我们推测抗CD3/抗Pgp Diabdoy和ARA—C联合应用可以增强细胞毒性T细胞的活性，达到更好的治疗效果。 本实验室构建了抗CD3/抗Pgp微型双功能抗体(Diabody)，并进行原核可溶性表达，体外实验证实具有良好的生物学活性，体内实验证实能有效地介导细胞毒性T淋巴细胞杀伤耐药移植瘤细胞。抗CD3/抗Pgp Diabody带有15肽的Etag纯化标记，可能引起免疫原性，影响其临床应用价值。并且抗CD3/抗Pgp Diabody在体内实验中，停药一周后肿瘤复发，不能彻底根除肿瘤。可能与体外活化的T细胞在体内不能维持其持续活化的状态，以及Diabody不稳定有关。本实验主要对抗CD3/抗Pgp Diabody进行了两项改进，分别为：①通过基因工程技术将抗CD3/抗Pgp Diabody的纯化标签Etag去除，降低免疫原性。与ARA—C联合应用治疗耐药裸鼠移植瘤。②向抗CD3/抗Pgp Diabody的抗CD3或抗Pgp可变区引入一对二硫键，增强其稳定性，提高疗效。 实验结果显示，去除Etag的抗CD3/抗Pgp Diabody生物学活性没有明显改变，与ARA—C联合应用，疗效大大增强，在观察窗内肿瘤没有复发。向抗CD3/抗Pgp Diabody的抗Pgp可变区引入一对二硫键后，二硫键不能正确配对。而向抗CD3/抗Pgp Diabody的抗CD3可变区引入一对二硫键后(dsCD3—Diabody)，二硫键能够正确配对，在原核系统可溶性表达。dsCD3—Diabody抗原结合活性没有明显改变，介导细胞毒性T细胞发挥杀伤效应的能力亦没有明显改变，而体内外稳定性大大增强，介导细胞毒性T细胞杀伤耐药移植瘤的作用增强一倍。 近二十年来，已经证实存在肿瘤干细胞，肿瘤干细胞的存在可能是肿瘤复发难治的根源。最近研究显示，急性髓系白血病(AML)细胞上Pgp蛋白的表达明显高于其他亚群的细胞，这样白血病干细胞(LSC)就容易逃脱化疗药物的杀伤作用，重新生长并增殖。研究同时发现，LSC上的Pgp蛋白虽然数量增多，但是其功能是降低的，这可能是ABCB1逆转剂临床治疗效果并没有预期那么好的原因之一。我们研制的抗CD3/抗Pgp Diabody是通过识别Pgp蛋白的三维结构，与之特异性结合，从而介导细胞毒性T细胞发挥细胞杀伤效应。因此，抗CD3/抗Pgp Diabody较ABCB1逆转剂具有更好的临床应用价值。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

第一部分去除Etag的抗CD3／抗Pgp微型双功能抗体构建、表达及活性研究

实验材料

实验方法

结果

讨论

结论

第二部分二硫键稳定的抗CD3／抗PGP的构建、表达及活性研究

实验材料

实验方法

实验结果

讨论

结论

综述1双特异抗体研究进展

综述2白血病干细胞形成和转录因子

参考文献

附录一常见英文缩略词

致谢

发表文章