pcDNA4.0(+)/exJSRV-env重组质粒的构建及其瞬时转染Hela细胞

摘要

绵羊肺腺瘤病(Ovine pulmonary adenomatosis,OPA)是由绵羊肺腺瘤病毒(exogenous Jaagsiektesheep retrovious,exJSRV)引起的一种慢性进行性传染性绵羊肺脏肿瘤疾病.JSVR具有相互重叠的gag、pro、pol、env的反转录病毒典型的基因结构,其中env基因编码病毒的囊膜蛋白(ENV),ENV主要负责病毒粒子与病毒的靶细胞的特异性结合,同时发生膜融合使病毒粒子侵入靶细胞内.为了进一步探索exJSRV囊膜蛋白的结构与功能,从而揭示绵羊肺腺瘤病的发病机理.本研究以绵羊腺瘤病的病肺组织为原料,提取总RNA并反转录为cDNA,以此cDNA为模板,F-env、R-env1、R-env2为引物,利用半巢式PCR扩增目的基因,胶回收纯化PCR产物并与真核表达载体pcDNA4.0(+)均用kpnⅠ和XbaⅠ限制性内切酶进行双酶切。T4DNA连接酶连接,转化DH5a感受态细胞,挑取15个单克隆,通过菌液PCR、质粒PCR、XbaⅠ单酶切、kpnⅠ和XbaⅠ双酶切鉴定后,选取酶切验证正确的菌液送Inviotrgen公司进行测序。同时将阳性克隆按Promega公司去内毒素中量质粒提取试剂盒PureYieldTM plasmid Maxiprep System说明书提取质粒(pcDNA4.0(+)/exJSRV-env),紫外分光光度计测其浓度为700μg/L,纯度为A260/A280=1.85,贮存于-20℃备用。用含有10%的胎牛血清和含1%双抗的DMEM高糖培养基培养Hela细胞,在转染前24h,用胰酶消化对数期生长的Hela细胞并计数,将细胞接种于24孔细胞培养板里培养,待细胞密度为80%-90%时,按LipoefcatamineTM LTX Reagent说明书要求进行转染实验,同时设阴性对照组。置于37℃、5%CO2培养箱中继续培养36h。最后裂解细胞,利用微量RNA提取试剂盒提取Hela细胞总RNA,利用RT-PCR检测目的基因的表达。结果表明质粒单、双酶切和测序结果证明本试验构建的pcDNA4.0(+)/exJSRV-env重组质粒的DNA序列完全正确,将其瞬时转染Hela细胞后,裂解细胞并提取总RNA,利用RT-PCR技术,琼脂糖凝胶电泳检测到目的基因env片段约2000bp,与预期大小一致。而阴性对照与空白对照组均无条带。说明pcDNA4.0(+)/exJSRV-env真核表达质粒构建成功,并能在Hela细胞内表达。