β-arrestin1调节急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)起始细胞的自我更新能力

摘要

目的:急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)约占儿童急性白血病的60％.B-ALL的5年无病生存率(DFS)超过80％,但是复发B-ALL的5年DFS仅40％-50％.造血起始细胞(LICs)是一群具有自我更新和增殖能力的细胞群,研究者多认为LICs是白血病产生和复发的根源.β-arrestins家族是多功能支架蛋白,调节G蛋白偶联受体信号.己证实β-arrestin1能进入细胞核,通过招募P300和CREB分子,与H4组蛋白启动子结合,增加H4K9组蛋白乙酰化,调控下游基因转录.但β-arrestin1在B-ALL,尤其及在LICs的功能未知.前期文献报道急性白血病细胞中PTEN、P15及P16等抑癌基因启动子异常甲基化,基因表达水平降低.因此,本研究中,重点探究β-arrestin1调节B-ALL的LICs自我更新能力及甲基化机制.方法:无菌采集典型初诊B-ALL患儿骨髓，利用免疫磁珠分选LICs，流式细胞术、克隆形成实验和NOD/SCID老鼠成瘤能力鉴定B-ALL的LICs。利用慢病毒shRNA载体技术构建p-arrestin1敲低的NOD/SCID小鼠模型，再接种B-ALL LICs成白血病模型;利用体外LICs细胞克隆形成实验、NOD/SCID小鼠二代移植技术观察LICs自我更新能力;利用甲基化特异性PCR技术(MSP)检测基因甲基化水平;RT-PCR、免疫组化与ELISA技术分别检测DNA甲基转移酶(DNM丁s>表达及酶活性;利用免疫荧光共聚焦技术(Confocal)、免疫共沉淀技术(Co-IP)等研究p-arrestin 1与甲基化调控的关键蛋白EZH2结合。结果:在B-ALL患儿的LICs细胞多功能蛋白p-arrestin1高度富集与表达增高。p-arrestin1缺失将削减B-ALL LICs在体内、体外启动白血病的能力及自我更新能力。发现B-ALL LICs中抑癌基因P下EN,P15及P16的甲基化水平降低，但他们的mRNA表达水平却升高。有趣的是，B-ALL LICs中DNMTs表达水平和酶活性均升高，且:氮杂胞昔(Aza>和5-氮-2脱氧胞昔(DAC)两种甲基化抑制剂均能明显抑制B-ALL LICs的DNM下s活性和自我更新能力。进一步研究发现p-arrestin 1敲减B-ALL LICs内，可降低DNMTs活性及抑癌基因甲基化水平，但却能增强P下EN,P15及P16抑癌基因的表达;Confocal和Co-IP技术结果均显示p-arrestin1能与EZH2结合，抑制p-arrestin1-EZH2与结合，可下调DNMTs活性、抑癌基因甲基化及B-ALL LICs的自我更新能力。结论：p-arrestin1通过与EZH2结合，上调抑癌基因启动子甲基化水平，增强B-ALL LICs自我更新能力，为表观遗传成为儿童B-ALL治疗新靶点提供了理论证据。