2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的作用及机制研究

摘要

目的：本研究通过观察2,3,5,4-四羟基二苯乙烯-2-0-β-D-葡萄糖苷对大鼠骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶和骨钙素表达的影响，以阐明其对MSCs成骨分化的作用,以及作用的时效和量效关系；观察TSG对Wnt/β-catenin信号通路相关基因和蛋白表达的影响，以阐明其是否通过调节Wnt信号通路发挥促进MSCs成骨分化的作用,由此探讨TSG对干细胞分化方向的调节作用及作用机制。方法：全骨髓培养法分离纯化BMSCs,流式细胞仪鉴定细胞表面抗原,油红染色法观察判断是否成功诱导MSCs向脂肪细胞方向分化.碱性磷酸酶染色法与茜素红染色法观察判断是否成功诱导MSCs向成骨细胞方向分化.应用MrTT法检测TSG对体外培养大鼠骨髓间充质干细胞增殖的影响.对硝基苯磷酸盐法和双抗体两步夹心酶联免疫吸附法检测TSG对体外培养大鼠骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶和骨钙素的影响,实时荧光定量PCR法检测TSG对成骨分化相关基因Runx2、Col1a1 mRNA表达的影响,以观察TSG对MSCs增殖和成骨分化能力的作用,以及这种作用的时效和量效关系.免疫印迹法和实时荧光定量PCR法观察TSG对Wnt/β-catenin信号通路关键靶点蛋白Dickkopf-1、Gsk3 β、β-catenin以及基因Gsk3β、β-catenin mRNA表达,以观察TSG对大鼠骨髓间充质干细胞Wnt/β-catenin信号通路的调节作用.结果：全骨髓贴壁法纯化后得到形态均一,呈长梭形的细胞,其间存在间充质干细胞,经不同诱导条件,能向成骨细胞和脂肪细胞方向分化,未经诱导的细胞局部出现钙化现象,流式细胞仪检测细胞表面抗原CD29和CD90呈阳性,CD45呈阴性.10-4mol/L、10-5mol/L、10-6mol/L TSG作用24、48、72小时，细胞数量均比对照组多，其中10-4mol/L TSG作用48和72小时、10-5mol/L TSG作用72小时能促进BMSCs增殖(P＜0.05)。TSG还能促进胞浆内碱性磷酸酶表达,l0-4mol/L、10-5mol/L、10-6mol/L TSG作用3天、5天、7天能升高BMSCs胞浆内碱性磷酸酶表达,差异有统计学意义(P＜0.05),而且这种作用在第5天达到高峰.10-4mol/L、10-5mol/L、10-6mol/L TSG作用7天可使骨钙素含量升高(P＜0.05).10-5tool/L、10-6mol/L的TSG处理BMSCs5天可上调成骨分化基因Runx2和Collal的mRNA的表达(P＜0.05).310-5mol/L、10-6mol/L的TSG处理BMSCs5天,DKK1、β-catenin和GSK-3β3蛋白表达升高,β-catenin和GSK3β mRNA表达升高.结论：TSG可促进大鼠骨髓基质干细胞增殖,同时促进其向成骨细胞方向分化，促进MSCs表达碱性磷酸酶刺激骨钙素的分泌，上调成骨分化基因Runx2和Col1a1的mRNA的表达.TSG促进大鼠骨髓基质干细胞向成骨细胞方向分化的作用可能与调控Wnt/β-catenin信号通路有关。