鸡传染性贫血病毒LAMP检测方法的建立

摘要

目的：建立鸡传染性贫血病毒的环介导等温扩增(LAMP)技术,以便简单、快速、特异地检测CAV,同时搭建LAMP技术平台.方法：选取GenBank中69株CAV序列,利用DNAstar软件包中的MegAlign软件对上述序列进行比对,选择第300bp～1050bp的保守序列区域,使用在线设计软件Pirmer Explorer V4软件对引物进行设计并筛选,以CAV阳性质粒为模板用3对LAMP引物进行等温扩增,扩增产物分别进行电泳、SupergreenⅠ荧光染色以及酶切鉴定,正确后对该方法的反应体系及反应条件进行梯度优化.结果：根据引物设计优化结果,最终选定的引物组选取了215bp～395bp的181bp序列作为扩增片段;扩增产物电泳呈LAMP特有的拖带,能被PstI和BgⅢ有效酶切,Superee nI染色后肉眼可见特有的绿色荧光,阴性产物呈红棕色;经优化后25μL体系的最佳反应条件为:dNTPs(10 mmol/L)0.3μl、FIP/BIP(100 umol/L) 0.3μL、F3/B3(10umol/L) 10μmol/L、LF/LB (10umol/L) 10μmol/L、Betaine (5mol/L) 5.0μμL、MgC12 (25mmol/L) 2.5 μL、Bst DNA Polymerase 1μl、10×ThermoPolbuffer 2.5μl、模板DNA2μl,超纯水补至25μL;65℃温浴1h,80℃灭活5min.结论：成功建立了CAV的LAMP检测方法,为基层实验室的快速诊断及CAV防控提供了技术支撑,同时为其它病原的LAMP方法的建立奠定了基础.