绵羊肺腺瘤逆转录病毒env基因截短表达及其多克隆抗体的制备

摘要

以本实验室构建好的pCDNA3.1-exJSRV-env质粒为模板，PCR扩增env基因1 320bp片段，对应的exJSRV全长基因位置为5498～6529bp。定向克隆到pET32a(+)表达载体中，通过PCR,酶切，测序，鉴定筛选出阳性克隆菌并提质粒转化到Transetta(DE3)表达菌中，用终浓度为1mmol/L的IPTG , 37℃诱导6h后取1mL菌液，取菌体超声后离心，分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE检测目的蛋白表达。改变IPTG浓度，诱导的时间和温度，确定最佳诱导表达条件。经western-blot鉴定重组蛋白后用镍柱亲和层析的方法纯化重组蛋白。测定纯化的重组蛋白浓度后，免疫新西兰大耳白兔制备抗血清，用间接ELISA,western-blot法检测抗血清效价，用感染JSRV绵羊的肺脏做免疫组化检测抗血清的特异性。结果表明，成功构建了ex-JSRV-env基因的截短原核表达质粒，并成功的表达了带有His标签的重组融合蛋白。重组蛋白主要以包涵体形式表达，最佳表达条件是终浓度为1mmol/L的IPTG，在37℃诱导6h，重组蛋白可达到最高表达量，诱导6h后再延长诱导时间，重组蛋白的表达量不会随时间延长而增加。在变性的条件下用镍柱亲和层析的方法纯化重组蛋白，经缓慢透析去除尿素使蛋白复性，用超滤离心法浓缩透析后的重组蛋白，用BCA法测定蛋白浓度为0.9 mg/mL，免疫新西兰大耳白兔制备的抗血清效价为1:25 600,western效价为1:2000,感染JSRV的绵羊肺脏免疫组化的阳性信号主要在肺泡Ⅱ型细胞和肺泡侵润的淋巴细胞中，说明表达的重组蛋白具有良好的抗原性，免疫原性和特异性，可用于JSRV诊断试剂的研究。