不同电荷金纳米颗粒的体外细胞毒性及其机制研究

摘要

目的:通过体外试验评价不同表面电荷的金纳米颗粒对肝癌细胞和正常肝细胞的毒性作用,预测受试物的体外细胞毒性,并进行进一步的毒性机制研究. 方法:通过MTT法检测不同电荷金纳米颗粒对HepG2肝癌细胞和正常肝细胞L02的存活率的影响,采用流式细胞术Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡和PI单染法检测细胞周期改变,使用活性氧指示剂2',7'二氯双氢荧光素二乙酸酯研究金纳米颗粒在细胞水平产生活性氧的情况,采用彗星试验检测DNA的损伤作用,Western blot检测有关细胞内蛋白caspase3、p53和TLR2表达水平的改变,Elisa法检测细胞因子IL-6和IL-1a表达水平的改变等. 结果：MTT试验中，UEI（聚乙烯亚胺修饰带正电荷）的金纳米颗粒在10-40μg/mL剂量范围时,分别作用HepG2和L02细胞24h后，细胞活性均有下降趋势；AUA（氨基和非功能性聚乙二醇修饰的呈电中性）的金纳米颗粒在较高剂量（20μg/mL和40μg/mL）下，作用Hep G2细胞24h后，细胞活性减小；而AUH在同样剂量条件下，分别作用两种细胞24小时后，细胞活性并没有减少。在流式细胞术检测中，UEI在40 μg/mL剂量下作用4小时，能够诱发Hep G2和L02细胞出现凋亡；UEI在高剂量40μg/mL时，能够导致Hep G2细胞的G1缩短，G2期严重阻滞，而在同样剂量下对L02细胞周期也有G2期阻滞，但是比较轻微；AUA在Hep G2细胞毒性剂量（40μg/mL）下，并未诱发凋亡和周期的改变。UEI作用的两种细胞中，均有大量的活性氧产生。Western blot检测细胞内蛋白caspase3，TLR2和p53表达水平的改变，UEI在毒性剂量下，能引起Hep G2和L02细胞capase3减少，TLR2增加；同时UEI作用Hep G2细胞后，p53的表达增加，而作用L02后p53蛋白的表达水平没有明显改变；AUA作用两种细胞后，引起Hep G2的TLR2表达增加，而L02的TLR2表达水平未改变，同时caspase3和p53蛋白表达水平也未见明显改变。AUH（羧基修饰带负电荷）的金纳米颗粒并未引起caspase3，TLR2和p53蛋白表达水平的明显改变。Elisa试验发现，UEI和AUA作用Hep G2细胞，培养上清中IL-6细胞因子含量增高; AUH作用Hep G2细胞，培养上清中IL-6细胞因子含量没有改变; UEI能引起L02细胞上清中两种细胞因子IL-6和IL-1a的明显增多。 结论：UEI（+61.4mV）在体外对Hep G2和L02细胞均有明显细胞毒性作用，AUA（+2.24mV）在高剂量时对肝癌细胞表现出轻微的细胞毒性，而AUH（-13.8mV）在本试验条件下并没有表现出细胞毒性。说明细胞毒性大小与金纳米颗粒的表面正电荷大小有关，肝癌细胞对正电荷的细胞毒性的影响更敏感。正电荷的金纳米作用肝癌细胞和正常肝细胞产生毒性的机制不完全相同，聚乙烯亚胺修饰金纳米（UEI）能通过改变p53的表达，显著地影响肝癌细胞的周期。