猪血清淀粉样蛋白3(SAA3)分子SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

摘要

本实验利用SYBR GreenⅠ荧光定量技术建立一种绝对定量检测猪血清淀粉样蛋白3(SAA3)的方法.根据GenBank中登录号为NM_00104552.1的猪血清淀粉样蛋白3(SAA3)的全长基因序列,设计特异性引物,扩增猪SAA3的ORF区域,并将PCR扩增片段连接到pFlag7.1载体上构建重组质粒,根据登录号为AF017079.1的猪GAPDH的基因全长序列设计特异性引物,并将PCR扩增片段连接到pMD18T载体上构建重组质粒.本研究成功构建了体外转录的标准品RNA，建立了检测猪SAA3的荧光定量PCR方法。结果显示标准曲线线性关系R值均在0.98以上;特异性结果表明只能检测到猪SAA3,GAPDH扩增曲线;组内和组间变异系数均小于5%。用建立的荧光定量PCR的方法对正常以及感染猪繁殖与呼吸综合征病毒的肺泡巨噬细，正常以及感染猪繁殖与呼吸综合征病毒的猪组织进行检测，结果都能检测到猪SAA3，并在正常组与接毒组之间显示出明显的差异。本研究初步建立了检测猪SAA3基因的SYBR Green荧光定量RT-PCR的方法，为后续对猪传染性疾病与猪SAA3之间相互关系的研究提供了一种特异、灵敏的检测方法。