川牛膝MSAP反应体系的优化及引物筛选

摘要

目的：首次对川产道地药材川牛膝表观遗传多样性进行研究,建立并优化川牛膝甲基化敏感扩增多态性技术(MSAP)最佳反应体系. 方法：以川牛膝苗期叶片为材料,利用正交试验设计对川牛膝MSAP反应体系中预扩增和选择性扩增中关键影响因素进行考察,建立川牛膝MSAP反应最佳体系. 结果：川牛膝MSAP最佳反应体系为：酶切体系(20μL),250ng DNA、0.5μL EcoRI、0.1μL HpaⅡ或0.3μL MspⅠ(HpaⅡ);连接体系(15μL)：10μL酶切产物、0.5μL EcoRI adaptor、0.5μL HpaⅡ/MspⅠadaptor、0.5μLT4连接酶;预扩增体系(20μL)：连接产物1μL、rTaq酶1U、引物分别1μL、dNTP(Mg2+)2μL;选择性扩增体系(20μL)：预扩产物稀释50倍、rTaq酶1U、引物1μL、dNTP(Mg2+)3μL,并运用优化后的体系,最终从川牛膝MSAP的256对引物中筛选出有效引物6对. 结论：优化后的体系保证了稳定的图谱、清晰的条带,筛选出的6对引物组合特异性好,能够用于后续川牛膝DNA甲基化相关实验研究,同时,为其他药用植物MSAP分析提供了参考.