树突状细胞提高LAK细胞对小鼠卵巢癌杀伤作用的实验研究

摘要

目的：利用小鼠卵巢癌OVHM肿瘤细胞抗原体外致敏小鼠树突状细胞(dendritic cell，DC)，研究肿瘤抗原致敏的DC对LAK细胞体内外抗肿瘤作用的影响，为肿瘤免疫细胞治疗提供实验依据。rn 方法：取对数生长期的OVHM细胞制备肿瘤抗原。从小鼠腿骨中获得骨髓细胞，加入抗CD4、抗CD8a、抗B220、抗Ter119和抗CD11b单克隆抗体，应用免疫磁珠阴性筛选法(Mini-MACS)去除粒细胞、T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞和巨噬细胞后，与rmGM-CSF和rmIL-4体外共培养，培养过程中加入小鼠OVHM卵巢癌细胞冻融抗原致敏DC，以获得特异性、大量、高纯度DC。流式细胞仪检测DC的免疫表型，ELISA法检测DC培养上清分泌的细胞因子IL-12。无菌制备小鼠脾细胞悬液，利用梯度密度离心法收获脾淋巴细胞，体外与IL-2共培养，扩增诱导为LAK细胞。肿瘤抗原致敏的DC与LAK细胞共培养，收获DC-LAK细胞。4DC诱导LAK细胞的体外杀伤实验：效应细胞分为小鼠脾淋巴细胞组、单纯LAK细胞组和与肿瘤抗原致敏DC共培养LAK细胞组(DC-LAK)；分别在不同效靶比(10：1及50：1)条件下以MTT。法检测LAK细胞的体外杀伤活性(靶细胞为OVHM)。将小鼠OVHM接种于C57BIJ6NxC3H/He杂交一代(B6C3F1)雌性小鼠右前肢腋窝皮下(5×105/只)，建立肿瘤模型，并随机分为四组，对照组(单纯注射PBS)、LAK治疗组、肿瘤抗原致敏DC治疗组、DC-LAK治疗组，每组6只。从荷瘤第2天开始治疗，分别于荷瘤周围皮下注射LAK细胞、经OVHM抗原致敏DC和DC-LAK细胞(1×108/ml)0.1ml/只。从荷瘤第6天开始，每隔2天测量肿瘤大小，按公式V=πab2/6 计算瘤体积，第30天处死小鼠，剥离肿瘤组织称重并观察各组抑瘤效果有无差异。rn 结果：应用Mini-MACS分选系统可获得高纯度(>80％)的DC，平均每只小鼠收获DC细胞1.5×106。电子显微镜观察：DC表面突起多样化，细胞呈树突状。与未用肿瘤抗原致敏的DC比较，肿瘤抗原致敏的DC，CD80、CD86和HLA-DR表达明显增高，分泌IL-12水平明显增高，可刺激LAK细胞增殖反应显著增强，培养7天可扩增5～6倍；效靶比为50：1时，小鼠脾细胞的体外杀伤作用较低(11.38±3.83％)，单纯LAK细胞则有较强的杀伤活性(46.73±6.71％)，两者相比较差异有显著性(P<0.01)，而DC-LAK对OVHM细胞杀伤作用最强(79.66±4.82％)，与其它两组比较，差异均有显著性(P<0.01)。动物实验结果显示，对照组、LAK、DC和DC-LAK组小鼠肿瘤平均瘤重分别为2.992±0.130、1.551±0.109、0.513±0.217和0.185±0.214g，对肿瘤生长的抑制率分别为48.16％、82.85％和93.81％；各组肿瘤体积分别为3.7734±0.163、1.118±0.134、0.588±0.401和0.1480±0.027cm3。各治疗组分别与对照组比较，有显著性差异(P<0.01)。DC-LAK组与其它各组抑瘤率比较有显著性差异(P<0.01)。rn 结论:应用免疫磁珠阴性筛选方法在去除粒细胞、T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞和巨噬细胞后，可纯化小鼠骨髓DC细胞，体外联用rmGM-CSF和rmIL-4培养，同时经肿瘤细胞冻融抗原致敏，可扩增高纯度成熟DC。肿瘤冻融抗原致敏的DC与LAK细胞共培养后可明显提高LAK细胞特异性杀伤肿瘤作用。