新型小分子化合物OIC-A006的骨诱导机制及其性能的研究

摘要

目的：探讨新的合成性小分子化合物OIC-A006(Osteogenicinducible compound-active 006)诱导成骨性及其发生机制，综合评价其骨修复性能，期以克服骨诱导因子在临床应用中的局限性，并为该化合物的研发应用和更广范围的筛选骨诱导化合物提供理论指导依据。rn 方法：取1．5月龄的雄性C57BL／16小鼠，原代培养骨髓间充质干细胞(Bone marrow stem cells，BMSCs)，应用MTF法检测：BMSCs的增殖活性；当细胞融合至80％后，分别以含0、3．1、6．25、12．5和25μM的OIC-A006条件培养液干预，在干预后第5、10、15、20、25天时，应用各种成骨性标志基因的变化趋势并确定其诱导成骨的最适浓度；取新生1天的C57BL／6小鼠的颅骨和跖骨作骨组织旋转培养，应用组织化学染色和四环素荧光标记检测其骨量和骨体积变化及新骨形成情况；分别将一定浓度的该化合物溶液注射至健康成年小鼠股后部肌袋内，应用组织化学等技术观察其体内的异位骨形成情况，体内外了解OIC-A006的骨诱导性能。通过Western-blot等技术，检测BMSCs的Smad4蛋白表达情况；利用RNAi技术，阻遏smad4转录，时检测OPN在OIC-A006影响下表达情况；克隆含OPN启动子基因的cDNA片段，构建OPN启动子/荧光酶素报告基因表达载体系统，转染载体至293T细胞，在含特定浓度OIC-A006的条件培养液干预下培养，通过检测荧光酶素活性来确定OPN的表达情况．以了解和验证OIC-A006的骨诱导作用有可能是模拟BMPs的功效并通过BMPs／Smads通路而发挥的。制备兔颅骨临界性骨缺损模型，在缺损处分别植入含一定浓度的OIC-A006的煅烧骨颗粒复合物或单纯煅烧骨颗粒。于术后不同时相：应用X-线检查骨修复进展状况；应用微CT(μCT)测量骨体积和骨小梁构筑；应用四环素标记技术观测新骨形成情况。综合比较分析OIC-A006的骨修复复合材料的骨修复性能。rn 结果：与空白对照组相比，在含不同浓度的OIC-A006条件培养液干预下，BMSCs增殖活性的变化不明显，但可刺激BMSCs表达ALP、OC、OPN等成骨性标志基因，这种作用主要表现在含6．25μM浓度的OIC-A006组：在含6．25μM浓度的OIC-A006条件培养液干预培养下，新生小鼠颅骨及跖骨体积和骨量明显增加；将OIC-A006注射至小鼠股后部肌袋内检测,1周后即可以通过组织化学染色发现有明显的软骨和细胞外特异性异染物质形成。在OIC-A006诱导骨形成的同时,细胞内smad4蛋白表达明显增加；当应用RNAi技术阻遏smad4的转录及表达后，OIC-A006的骨诱导活性明显减弱；通过检测在293T细胞中OPN启动子的表达情况，结果显示OIC-A006对OPN转录活动具有明显的促进作用。因此认为,OIC-A006呈现类似BMPs的作用，其骨诱导性可通过激活细胞内Smads途径和直接激活OPN启动子二方面的作用而实现的。较之煅烧颗粒骨移植,煅烧颗粒骨复合一定剂量的OIC-A006移植至临界骨缺损后，骨缺损区域骨量增加，骨修复区域增大，骨修复作用明显增强；新骨形成速率提高，骨体积、骨量等多项指标均相对于对照组明显增多，骨形态塑性明显。含OIC-A006的煅烧颗粒骨复合材料移植呈现出明显的促进骨修复作用。rn 结论：新的合成性小分子化合物OIC-A006可通过增强细胞smad4的作用功效与直接促进OPN启动子转录而发挥骨诱导性；含OIC-A006的煅烧颗粒骨复合材料,具有明显的促进骨修复的作用。