高效液相色谱法同时测定血浆L-精氨酸和L-瓜氨酸浓度

摘要

建立一种用反相高效液相色谱(RP-HPLC)同时测定血浆乙精氨酸和L-瓜氨酸浓度的方法并应用于临床。血浆样本用三氯乙酸及在75～肋80℃温育15min除蛋白,离心10000g,15min后,上清液用苯基异硫氰酸酯(PITC)溶液衍生化,氮气吹干,流动相A定客。梯度洗脱,流动相A;500mL含4.77gNaAc,12.5mL乙腈,125μL10mmol/LEDTA;流动相B;由75mL甲醇,225mL乙腈及200mL超纯水混合组成。采用PICO-TAG色谱柱[300×3.9mm,5μm]分离样本,柱温46℃,流速1.0mL/min,进样量20μL,紫外检测器检测,波长254nm。L-精氨酸和L-瓜氨酸浓度线性范围0～1000μmol/L,线性回归方程分别为Y=892.1697+4278.031X(Syx=6767.05,Sa=2757.27,Sb=7.167)及Y=15531.02+4272.131X(Syx=30160,Sa=13345,Sb=33.99),两者r2均大于0.9999;精氨酸和瓜氨酸的方法检测限分别为0.0476μmol/L和0.0201,μmol/L,定量下限(LOQ)分别为0.448μmol/L和0.240,μmol/L。日內变异系数CV(％)分别为3.2％和3.4％,日间变异系数CV(％)分别为4.9％和7.2％。平均回收率分别在86.69％～93.06％及86.22％～118.9％之间。用本法测定的39例健康人(男23例,女21例,23～73岁)血浆L-精氨酸和L-瓜氨酸浓度分别为58.19±16.43μmol/L及60.77±9.18μmol/L。乙采用三氯乙酸沉淀血浆蛋白并加温,减少了热变性蛋白的干扰并有利于延长色谱柱的使用寿命;所建方法灵敏、重现性好、结果可靠,可应用于临床和科研。