感染BmNPV家蚕中肠组织cDNA文库的构建

摘要

为了探索家蚕核型多角体病毒（BmNPV）蛋白间的相互作用，采用CLONTECH SMART（switching mechanism at 5′end of RNA transcript)技术，在酵母菌株Y187中构建了感染BmNPV家蚕中肠组织的cDNA文库。家蚕五龄天添食BmNPV，提取感染后12小时与96小时家蚕中肠组织的总RNA并混合均匀。利用经修饰的CDSⅢ引物 cDNA第一链，在反应体系中再加入SMARTIII-modified Oligo作为cDNA第二链合成的引物，进行长距离LD- 合成双链cDNA，后者经CLONTECH CHROMA SPINTE-400柱纯化后，与线性载体质粒pGADT7-Rec共转化受态酵母菌Y187中，二者利用酵母细胞内较高的同源重组酶活性，进行同源重组产生环形有复制活性的文库然后在缺亮氨酸(LEU)培养基板上筛选出所有克隆，即为感染BmNPV家蚕中肠组织的cDNA文库。实验结果提取RNA的A260/A280=1.82，纯度较高；双链cDNA文库大于0.2 kb，且弥散较长，成瀑布条带状；该文库具因多样性和足够大的库容量，共获得6.8×108 转化子，滴度为4.4×107cfu/ml，文库扩增后，插入cDNA的平均为750bp，文库的重组率为95%。该文库的构建为筛选相互作用蛋白并进一步阐明其生理意义提供了基础。