BmNPV病毒感染后家蚕中肠围食膜蛋白质的变化

摘要

围食膜(peritrophic membrane，PM)是无脊椎动物为适应其生理活动，在漫长的进化过程中形成的一种具有渗透性的非细胞透明网状膜结构，由中肠细胞分泌并贯穿于整个中肠，主要由几丁质，蛋白质和碳水化合物等组成的蛋白质多糖基质膜。PM存在于食物和中肠上皮细胞之间，不仅在营养物质的消化和吸收中发挥了重要作用，并能够保护中肠上皮细胞免受来自粗糙食物颗粒的磨损，也是抵御经口感染的病源微生物侵害的第一道物理屏障。家蚕脓病是由家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nuclearpolyhedr osisvirus，BmNPV）引起的蚕丝产业的主要病害之一，给养蚕业造成了巨大的损失。虽然BmNPV感染家蚕细胞的研究报道较多，但从个体水平系统分析BmNPV为代表的病毒与家蚕相互作用的机制还未阐明，特别是病毒与中肠围食膜间相互作用关系的研究还相当有限，特别是家蚕围食膜蛋白与BmNPV相互作用的细节还所知不多;基于此我们对BmNPV感染后家蚕幼虫中肠PM蛋白组分的变化进行研究;可以为研究BmNPV侵染家蚕后宿主的反应提供实验数据，也为昆虫围食膜结构和功能等的研究补充理论知识，还可以为发现新害虫生物防治的潜在靶标及开发更加有效的生物杀虫剂提供理论基础。
　　本文通过SDS-PAGE，生物信息学手段和荧光定量PCR等技术，分析了围食膜蛋白质的种类、糖的含量，检测了BmNPV侵染后家蚕围食膜蛋白的变化并对其机理进行了初步分析。试验用双向电泳分离家蚕围食膜蛋白，以期获得在不同时期响应病毒感染的宿主蛋白的确切信息。
　　研究结果:
　　1.生物学测定结果显示:家蚕4龄幼虫注射10μl1 x105，1 x106和1 x107三个浓度BV粒子，连续统计4天死亡率。第三天死亡率分别为3.33％、6.67％、35.56％，四天死亡率均为100％。显示感染率与病毒浓度有关，且致死浓度大大小于经口感染的致死浓度，进一步证实家蚕中肠组织中的肠液与围食膜在抵御病毒侵染过程有重要作用。
　　2.家蚕围食膜总蛋白及糖含量:
　　SDS-PAGE电泳检测围食膜总蛋白至少有19条带，分布在11-245KDa，其中63KDa以上有5条，50-63 KDa有2条，17-50 KDa有7条，17 KDa以下有5条，以100KDa以下的中低分子量蛋白为主。
　　围食膜总蛋白含量约占围食膜总量的41.04％，碱性蛋白23.46％，酸性蛋白17.61％。糖含量0.156％。围食膜总蛋白含量、类型及分子量范围与其他鳞翅目昆虫相似，但糖含量远远低于其他昆虫，其中意义目前未知。
　　3.BmNPV病毒感染后围食膜蛋白质的变化:
　　3.1发现BmNPV感染6h、8h、12h和48h家蚕围食膜蛋白SDS-PAGE电泳检测无明显差异。4h分子量大约在30KDa及175KDa条带出现明显的蛋白含量下降。24h和72h在58KDa也出现明显的蛋白含量下降。显示BmNPV感染家蚕后围食膜蛋白质发生明显变化，且变化时间与观察到的围食膜受病毒感染后表面结构的变化时间基本一致。
　　3.2将含量下降的蛋白质条带对应的对照条带切割后质谱鉴定，发现BmNPV感染4h量下降的围食膜蛋白有7个:氨肽酶（BM_08059），丝氨酸蛋白酶(BM_14428，BM_12791，BM_10024，BM_14429)，几丁质结合蛋白2（BM_01491）和未知序列(XP_004925459.1|)。BmNPV感染24h量下降的围食膜蛋白有8个:未知蛋白(XP_004923455.1)，β-1，3-葡聚糖识别蛋白质前体4(NP_001159614.1)，类糜蛋白酶BI(XP_004928997.1)，类跨膜丝氨酸蛋白酶9(XP_004925969.1)，碱性磷酸酶(BAG41975.1)，类α-淀粉酶4N(XP_004933429.1)，类丝氨酸蛋白酶
　　3(XP_004928982.1)，类肠粘蛋白5AC(XP_004931813.1)。BmNPV感染72h量下降的围食膜蛋白有10个:昆虫中肠脂酶6(BM_02669)，几丁质去乙酰基酶（BM_13756，BM_13757），丝氨酸蛋白酶（BM_12777，BM_08280，BM_08818），羧肽酶（BM_04797， BM_04801），抗糜蛋白酶-1前体（BM_01983），几丁质结合蛋白(BM_01504)。
　　4.BmNPV感染后围食膜蛋白编码基因表达水平变化:
　　4.1 BmNPV病毒感染后蛋白量下降的围食膜蛋白基因芯片分析:
　　组织芯片分析显示除羧肽酶(BM_04801)在中肠的表达量较低外，其它基因均在中肠高量表达。不同发育时期芯片分析显示除丝氨酸蛋白酶（BM_08280）在上蔟高量表达外，这些蛋白基因均在家蚕5龄食桑期高量表达;显示本实验获得的降解蛋白主要是中肠表达的参与中肠消化和抵抗外原微生物。
　　4.2荧光定量PCR检测BmNPV感染组与对照组mRNA表达水平变化
　　病毒侵染4h:丝氨酸蛋白酶(BM_14428)基因显著上调表达，而丝氨酸蛋白酶(BM_12791)和氨肽酶(BM_8059)基因表达水平显著下调，胰蛋白酶(BM_10024)表达水平无显著差异。病毒侵染72h:几丁质去乙酰基酶（BM_13757）和丝氨酸蛋白酶（BM_12777）基因表达量无显著变化，而几丁质去乙酰基酶(BM_13756)和几丁质结合蛋白（BM_01504）及金属羧肽酶A类（BM_04797）基因表达水平显著下调。
　　本实验结果显示出感染病毒后不同时间宿主的围食膜蛋白质的改变，为我们解析出病毒感染后家蚕宿主响应病毒感染的防卫顺序和重要的相关围食膜蛋白，如氨肽酶在病毒入侵早期可能的辅助作用，在中肠高表达的丝氨酸蛋白酶超家族和几丁质去乙酰基酶家族不同成员在功能上的不同分化。这些结果，为解析家蚕对病毒感染的免疫应答的分子机理和找到宿主关键的抗病毒相关因子奠定了基础。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 昆虫中肠围食膜的结构与功能

1．1．1 昆虫中肠围食膜的形成

1．1．2 昆虫中肠围食膜的结构与组分

1．1．3 围食膜的功能

1．2 昆虫中肠围食膜蛋白的类型及特征

1．3 杆状病毒感染昆虫后相关生理病理研究

1．3．1 昆虫杆状病毒生活史

1．3．2 杆状病毒感染后昆虫中肠及围食膜的变化

第二章 引言

2．1 研究背景及意义

2．2 主要研究内容

2．2．1 提取家蚕囤食膜蛋白和生化分析

2．2．2 BmNPV感染家蚕幼虫后围食膜蛋白组分变化情况的分析

2．2．3 BmNPV感染后围食膜蛋白编码基因的表达变化

2．3 实验技术路线

第三章 家蚕围食膜总蛋白的分析

3．1 材料试剂

3．1．1 生物材料的准备

3．1．2 主要试剂

3．1．3 主要仪器

3．1．4 主要试剂的配制

3．2 方法

3．2．1 家蚕4龄幼虫注射杆状病毒BV粒子后连续4天死亡率的统计

3．2．2 家蚕S品系幼虫围食膜蛋白及含糖量分析

3．3 实验结果

3．3．1 家蚕4龄幼虫注射杆状病毒BV粒子后连续4天死亡率的统计

3．3．2 家蚕S品系5龄3天幼虫围食膜蛋白及糖含量的测定

3．3．3 家蚕S品系5龄3天幼虫围食膜总蛋白的SDS-PAGE电泳检测

3．4 讨论

第四章 BmNPV感染家蚕幼虫后围食膜蛋白的变化

4．1 材料和试剂

4．1．1 材料

4．1．2 主要试剂

4．1．3 主要仪器

4．1．4 主要试剂配制

4．2 方法

4．2．1 BmNPV感染家蚕幼虫

4．2．2 处理组和对照组的围食膜蛋白的提取

4．3 结果与分析

4．3．1 BmNPV感染后家蚕S品系幼虫围食膜蛋白的SDS-PAGE检测

4．3．2 双向电泳分离家蚕S品系围食膜蛋白组分

4．4 讨论

第五章 BmNPV感染后相关围食膜蛋白基因表达分析

5．1 材料

5．1．1 实验材料

5．1．2 主要试剂

5．1．3 主要仪器

5．2 方法

5．2．1 家蚕围食膜候选蛋白基因的生物信息分析

5．2．2 家蚕整蚕的RNA提取与cDNA制备

5．2．3 荧光定量PCR检测围食膜蛋白基因表达水平

5．3 结果与分析

5．3．1 BmNPV感染后相关家蚕围食膜蛋白基因分析

5．3．2 BmNPV感染相关的部分家蚕围食膜蛋白的生物信息分析

5．3．3 BmNPV侵染后部分家蚕围食膜蛋白基因的mRNA表达变化

5．4 讨论

第六章 结论

6．1 生物学测定结果

6．2 家蚕围食膜总蛋白与糖含量

6．2 BmNPV病毒感染后围食膜蛋白变化的检测

6．3 BmNPV感染后围食膜蛋白编码基因mRNA表达水平变化

6．3．1 BmNPV病毒感染后蛋白量下降的围食膜蛋白基因芯片分析

6．3．2 荧光定量PCR检测BmNPV感染组与对照组mRNA表达水平变化

参考文献

附录 缩略词表

致谢

发表论文及参加课题一览表