一株减少结肠病理损伤且具有缓解便秘作用的两歧双歧杆菌

摘要

本发明公开了一株减少结肠病理损伤且具有缓解便秘作用的两歧双歧杆菌，属于微生物领域。本发明提供的两歧双歧杆菌CCFM1165能够有效改善便秘小鼠的首粒黑便时间、肠道推进率、粪便含水量以及结肠组织的病理损伤。本发明菌株能够影响兴奋型和抑制型胃肠活性肽的含量，主要增加两种短链脂肪酸的含量，从而对便秘症状有所缓解。同时，两歧双歧杆菌能够有效增加粪便中双歧杆菌属的丰度，还能缓解结肠组织的病理损伤，从而发挥着全面缓解便秘疾病的作用。此外，与GDMCC NO.60939相比更好地增加血清中MTL的含量，促进结肠组织中5‑HT的分泌，且对小肠蠕动的推进作用更为显著，从而可以更加针对性地应用到疾病控制当中。

说明书

技术领域

本发明涉及一株减少结肠病理损伤且具有缓解便秘作用的两歧双歧杆菌，属于微生物领域。

背景技术

随着社会经济的发展和人们饮食结构的改变，便秘作为一种严重影响生活质量的疾病，受到越来越多的关注。有流行病学的调查显示，便秘在全球范围的发病率为0.7％-79％(平均达16％)；仅在我国就有3％-17％的发病率。

便秘主要表现为肠道内容物的传输较慢，对粪便中水分的吸收增加，排便次数以及排便频率降低，便意减弱甚至消失，同时伴有腹胀、粪便干结的症状。准确来说，便秘的判断可以依据罗马Ⅳ标准。对于长期便秘的患者，严重者常伴失眠、焦虑、抑郁、易怒，非常影响其身心健康及生活质量，其次，肠道中大量代谢产物会影响肠道发育甚至大脑功能，对整个心脑系统都会产生不利作用。

引发便秘的原因有很多，例如饮食的不均衡、微生物紊乱、药物的副作用、糖尿病等代谢性疾病所导致的并发症、遗传疾病、机械性肠梗阻、神经疾病等。针对不同的发病原因，治疗手段也不尽相同。对于病情较轻者，常鼓励他们多食用新鲜蔬菜、水果、豆类等膳食纤维含量丰富的食物，但是部分病情较为严重的患者，可以使用渗透性或刺激性泻药，如聚乙二醇、乳果糖或蒽醌衍生物等，但是这类泻药常会引起依赖性，甚至恶心、腹痛、腹泻等副作用，若患者已严重至肠道组织发生了明显的病变，则需要进行手术来进行治疗。因此，益生菌作为一种副作用较小、缓解效果较为明显，且依赖性较弱的治疗手段，目前已逐渐得到大家的广泛认可。

对于便秘患者，其肠道形态组织会发生一些改变，例如肠道肌肉、壁内神经丛和肠道Cajal间质细胞的异常。而胃肠道平滑肌作为其活动的最终效应器，其功能的缺失将导致结肠动力改变。益生菌作为缓解便秘症状的一种有效手段，能否对便秘患者的肠道组织有明显的改善作用已然成为研究的重点。

目前，针对双歧杆菌相关的生理功能已有国内外的学者进行研究，而其对便秘缓解作用的应用还应该得到更深刻的探究。无论是将其制成菌剂还是加入到食品中制成功能性食品，都有非常大的应用前景，能够预防便秘的发生甚至治疗便秘。通过对双歧杆菌缓解便秘进行研究，将会对食品科学、微生物学以及预防医学等各方面产生巨大的影响，因此，双歧杆菌缓解便秘的研究是十分必要的。

发明内容

技术问题

本发明要解决的技术问题是，提供一株能够明显减少结肠病理损伤且具有缓解便秘作用的两歧双歧杆菌，并且提供该菌株的应用。

技术方案

为了解决上述技术问题，本发明提供了一株两歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)，该菌株且与归一化后的GDMCC NO.60939菌株相比，血清素的含量能够增加19.67％，小肠推进率能够明显增加44.89％，提供相应益生菌制剂、发酵食品以及功能性食品，从而预防便秘，或使便秘患者能逐步摆脱药物治疗的副作用与局限性。

本发明提供了一株两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)，所述两歧双歧杆菌于2021年1月29日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC No：61480。

所述两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)来自于河南省封丘市2岁男童的粪便样品中，该菌株经测序分析，将测序得到的序列在NCBI Standard Nucleotide BLAST中进行核酸序列比对，结果显示与双歧杆菌属的核酸序列相似度为100％；结果显示菌株为两歧双歧杆菌，将其命名为两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1165。

所述两歧双歧杆菌CCFM1165具有下述生物学特性：

(1)菌体特征：革兰氏阳性，无芽孢，菌体约0.6-1.2μm×1.5-7.6μm，存在多个分枝，具有Y、V型。

(2)菌落特征：直径约0.3-2.4mm，圆形且边缘整齐，凸面或透镜状，微白，不透明，表面湿润光滑。

(3)生长特性：该菌株最适生长温度为36-38℃，32-38℃生长良好，最低生长温度为15℃，也能够在45℃下进行生长；最适初始pH为6-7，pH 5.5或以下生长较少；培养20h后进入稳定期前期，最终培养基的pH为4.0-4.8。

(4)对模拟胃肠液具有较好的耐受能力。

(5)具有粘附性，能够较好的粘附在结肠癌细胞HT-29上。

(6)能显著提高便秘小鼠的粪便含水量、首粒黑便时间以及小肠推进率，对盲肠内容物中短链脂肪酸含量的提高有很好的效果，其中，丁酸含量可以明显提高79.09％，且与归一化后的GDMCC NO.60939相比，小肠推进率能够明显增加44.89％，血清素的含量能够增加19.67％，并且能够改善结肠组织的病理损伤，降低结肠组织中水通道蛋白的表达量，调节血清中胃肠活性肽的含量，甚至明显增加粪便中双歧杆菌属丰度，其缓解便秘的效果良好。

本发明还提供了一种含有上述两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1165的微生物制剂。

本发明还提供了一种食品，所述食品中含有上述两歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)CCFM1165的微生物制剂。

在本发明的一种实施方式中，所述食品为发酵食品，所述发酵食品为使用两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1165发酵生产制得，所述发酵食品包括固态食品、液态食品、半固态食品。

在本发明的一种实施方式中，所述两歧双歧杆菌在食品中的添加量至少为10

在本发明的一种实施方式中，所述发酵食品包括乳制品、豆制品或果蔬制品。

在本发明的一种实施方式中，所述乳制品为发酵乳制品，包括发酵乳、发酵乳饮料、奶油、乳酪或乳粉；所述豆制品包括豆奶、豆乳饮料、豆乳粉；所述果蔬制品包括以白菜、白萝卜、黄瓜、甜菜、黄桃或杨梅为原料发酵的发酵果蔬饮品或食品。

本发明还提供了一种药品，所述药品中含有上述两歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)CCFM1165或上述微生物菌剂。

在本发明的一种实施方式中，所述药品包含两歧双歧杆菌CCFM1165以及能够在药学上允许的载体。

在本发明的一种实施方式中，所述载体包括医学上通常使用的填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、矫味剂中的一种或多种。

在本发明的一种实施方式中，所述药品的剂型包括颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液。

在本发明的一种实施方式中，所述两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1165在药品中的添加量至少为10

本发明还提供了上述两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1165或上述微生物菌剂在制备含有缓解便秘的产品中的应用。

本发明还提供了上述两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1165或上述微生物菌剂在制备具有以下至少一种功能性产品中的应用：

(a)缓解便秘，能够增加粪便含水量，促进肠道蠕动；

(b)改善结肠组织的病理损伤；

(c)增加兴奋型胃肠活性肽的水平，降低抑制型胃肠活性肽的水平；

(d)增加血清素及其受体4的含量与表达；

(e)降低结肠组织中水通道蛋白8的表达水平；

(f)增加盲肠内容物中乙酸、丙酸与丁酸的含量。

本发明还提供含有所述两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1165的菌剂。

在本发明的一种实施方式中，所述菌剂中两歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)CCFM1165的活菌数量≥10

在本发明的一种实施方式中，所述菌剂是将含有两歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)CCFM1165的菌液干燥得到的活菌数量≥10

在本发明的一种实施方式中，所述干燥是指真空冷冻干燥。

有益效果

(1)本发明的两歧双歧杆菌GDMCC No：61480活性较好，具有一定的耐酸碱性与粘附性，能显著提高便秘小鼠的粪便含水量、首粒黑便时间以及小肠推进率，调节血清中胃肠活性肽的含量，改善结肠组织的病理损伤，增加结肠组织中血清素及其受体的含量或表达量，减少结肠组织中水通道蛋白的表达量，将盲肠内容物中乙酸、丁酸、丙酸的含量显著提高47.17％、79.09％与46.73％。重要的是，两歧双歧杆菌GDMCC No：61480在粪便含水量、小肠推进率、MTL、SS、短链脂肪酸等指标上效果要明显优于酚酞药物，且与归一化后的GDMCCNO.60939相比，两歧双歧杆菌CCFM1165比GDMCC NO.60939更能显著提高血清中MTL的含量，提高结肠组织中5-HT的含量，从而对胃的收缩、胃液的分泌、肠道肌肉的收缩有显著的影响，提高小肠推进率，从而对肠道蠕动有更好的作用效果，有效缓解便秘。

(2)本发明可以视为一种缓解或治疗便秘的药物，还可以应用于药品或者是一些发酵食品及功能性食品中，从而广泛发挥其作用，具有非常有价值的应用前景。

生物材料保藏

一株两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1165，其分类学命名为：Bifidobacterium bifidum，已于2021年1月29日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：61480，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所。

附图说明

图1：两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1165菌株对用洛哌丁胺诱导产生便秘的小鼠缓解便秘相关指标(排首粒黑便时间、粪便含水量、小肠推进率)的示意图。

图2：两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1165菌株干预后，洛哌丁胺诱导便秘的小鼠血清中生长抑素(SS)含量变化示意图。

图3：两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1165菌株干预后，洛哌丁胺诱导便秘的小鼠血清中胃动素(MTL)含量变化示意图。

图4：两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1165菌株干预后，洛哌丁胺诱导便秘的小鼠结肠组织中血清素及其受体4的表达量变化示意图。

图5：两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1165菌株干预后，洛哌丁胺诱导便秘的小鼠结肠组织中水通道蛋白8(AQP8)表达量变化示意图。

图6：两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1165菌株干预后，洛哌丁胺诱导便秘的小鼠盲肠内容物中短链脂肪酸含量变化示意图。

图7：两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1165菌株干预后，洛哌丁胺诱导便秘的小鼠结肠组织切片病理变化示意图。

图8：两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1165菌株干预后，洛哌丁胺诱导便秘的小鼠粪便中双歧杆菌属丰度的变化示意图。

具体实施方式

下述实施例中所涉及的雄性C57BL/6J小鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。

下述实施例中所涉及GDMCC NO.60939菌株的保藏信息如下：

一株长双歧杆菌长亚种(Bifidobacterium longum subsp.longum)CCFM1112，其分类学命名为(Bifidobacterium longum subsp.longum)，已于2019年12月30日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO.60939，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所。

下述实施例中所涉及的培养基如下：

MRS液体培养基：牛肉膏10g；胰蛋白胨10g；酵母粉5g；葡萄糖20g；无水乙酸钠5g；MgSO

MRS固体培养基：在MRS液体培养基的基础上添加2％琼脂粉。

MRS+质量百分数(0.05％-0.1％)半胱氨酸的液体培养基：在MRS液体培养基的基础上添加0.08％半胱氨酸盐酸盐。

下述实施例中所涉及的两歧双歧杆菌菌悬液的制备

将两歧双歧杆菌接种至MRS固体培养基中，在37℃条件下培养72h得到单菌落，将制备得到的单菌落接种至MRS液体培养基中，在37℃条件下培养24h进行活化；

将活化3代后的菌液以2％的接种量接种至1L MRS液体培养基中，振荡混匀后于厌氧培养箱中37℃培养24h。在8000g/min，4℃的条件下离心15min，去上清后，用无菌生理盐水(含0.05％-0.1％的L-半胱氨酸盐酸盐)进行清洗2次，同样以相同条件进行离心，去上清后，用30％的甘油进行重悬，获得灌胃前备用菌液，-80℃冰箱冻存一周。

在进行动物实验前，将冰箱中冻存的菌液取出，以6000r/min离心5min，再用无菌生理盐水清洗两遍，用10％脱脂乳重悬菌液，震荡均匀后用平板倾注法测定初始和冻存一周后的活菌数量。

实验结果：初始活菌数为5.4×10

下述实施例中所涉及的5-HT4R基因的表达量的检测方法

采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)来测定5-HT4R基因的表达量，首先去要从新鲜组织中提取RNA，具体方法如下：

将小鼠解剖后取出的新鲜结肠组织0.2g在加有液氮的研钵(180℃，4h高温灭酶)中反复研磨，再向研钵中加入1mL TrizoL试剂，继续研磨，待液体基本澄清后，收集至1.5mL无酶离心管中，室温静置15min，向离心管中加入200μL三氯甲烷溶液，轻摇15s，室温静置10min，4℃、12000r/min离心15min，取600μL上层无色水相至另一只无酶离心管中，加入500μL异丙醇。上下颠倒混匀，室温下静置10min，静置结束后，4℃、12000r/min离心10min，弃去上清，留下RNA在离心管底部形成的白色沉淀，加入1mL用DEPC水配制的75％的乙醇溶液，漩涡震荡重悬，4℃、7500r/min离心5min，弃去上清，室温自然挥发干燥。向干燥的RNA中加入30μL RNase free water，待RNA溶解后，以Nanodrop测定RNA浓度及纯度，并通过琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量。以提取的总RNA为模板，根据康维世纪公司的HiFiScript gDNARemovaL RT MasterMix反转录试剂盒说明书操作步骤逆转录合成cDNA，-20℃下保存。

小鼠5-HT4R基因和内参基因mGAPDH基因引物如表1所示：

表1小鼠5-HT4R基因和mGAPDH基因引物序列

qRT-PCR反应体系及条件：

用

c-kit基因qRT-PCR反应体系为：

5-HT4R基因qRT-PCR反应条件为：

95℃30s；95℃10s，60℃30s，共40个循环。以mGAPDH基因作为内参基因，通过CFX96Manager软件分析结果。

下述实施例中所涉及的AQP8的表达量的检测方法

采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)来测定介导肠道分泌的AQP8的表达量，首先去要从新鲜组织中提取RNA，具体方法如下：

将小鼠解剖后取出的新鲜结肠组织0.2g在加有液氮的研钵(180℃，4h高温灭酶)中反复研磨，再向研钵中加入1mL TrizoL试剂，继续研磨，待液体基本澄清后，收集至1.5mL无酶离心管中，室温静置15min，向离心管中加入200μL三氯甲烷溶液，轻摇15s，室温静置10min，4℃、12000r/min离心15min，取600μL上层无色水相至另一只无酶离心管中，加入500μL异丙醇。上下颠倒混匀，室温下静置10min，静置结束后，4℃、12000r/min离心10min，弃去上清，留下RNA在离心管底部形成的白色沉淀，加入1mL用DEPC水配制的75％的乙醇溶液，漩涡震荡重悬，4℃、7500r/min离心5min，弃去上清，室温自然挥发干燥。向干燥的RNA中加入30μL RNase free water，待RNA溶解后，以Nanodrop测定RNA浓度及纯度，并通过琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量。以提取的总RNA为模板，根据康维世纪公司的HiFiScript gDNARemovaL RT MasterMix反转录试剂盒说明书操作步骤逆转录合成cDNA，-20℃下保存。

小鼠AQP8基因和内参基因mGAPDH基因引物如表2所示：

表2小鼠AQP8基因和mGAPDH基因引物序列

qRT-PCR反应体系及条件：

用

c-kit基因qRT-PCR反应体系为：

AQP8基因qRT-PCR反应条件为：

95℃30s；95℃10S，60℃30S，共40个循环。以mGAPDH基因作为内参基因，通过CFX96Manager软件分析结果。

下述实施例中所涉及的盲肠内容物中短链脂肪酸的浓度的检测方法如下：

将实验结束前所收集的盲肠内容物进行冷冻干燥，计算出盲肠内容物的干重，并冻存于-80℃。具体方法如下，称取20mg盲肠内容物，用500μL饱和NaCL溶液重悬，加入20μL10％H2SO4溶液；加入1000μL无水乙醚，震荡均匀，提取脂肪酸，然后12000rpm 4℃离心15min；取上层乙醚相，加入0.25g无水Na2SO4进行干燥；静置30min后12000rpm 4℃离心5min取上层乙醚相，利用GC-MS测定小鼠冻干盲肠内容物中的短链脂肪酸含量。

使用Rtx-Wax柱(柱长30m，内径25μm)；载气为He，流速为2mL/min；进样体积1μL,按7.5℃/min升温至140℃，然后按60℃/min升温至200℃保持3min,离子化温度为20℃；分析采用全扫描模式，为通过外标法测得标准曲线，从而计算出各种短链脂肪酸的浓度。

下述实施例中所涉及的粪便中双歧杆菌属的丰度的检测方法如下：

从-80℃冰箱中取出小鼠粪便200mg，按照Fast DNA Spin Kit for Feces(MPBiomedicals,catalog No.6570200)试剂盒的相关说明书进行提取，从而获得宏基因组DNA，并将所得的DNA进行PCR。

50μL的PCR的体系为：

2Taq Plus MasterMix(Dye)25μL，上游引物(10μmoL/L)1μL，下游引物(10μmoL/L)1μL，cDNA模板1μL，ddH2O 22μL。

PCR反应条件为：

95℃5min；95℃30s,52℃30s，72℃30s,共40个循环；72℃7min；12℃5min。

PCR后，于4％核酸染料，1.5％琼脂糖凝胶中进行电泳，将所得的条带分装于2ml的EP管中，使用DNA Gel/PCR Purification Miniprep Kit(Biomiga,BW-DC3511-01)按照相关说明进行纯化回收。通过NanoDrop测定所提取的DNA浓度，将样品进行等浓度混样，并建立相应文库用MiSeq测序器测序(Illumina,Santiago,CA,USA)。

实施例1：两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1165的获得

1、双歧杆菌菌株的分离筛选：

(1)使用一次性无菌取便器采集河南省封丘市2岁男童的粪便，将粪便样品在含有低聚果糖的MRS+质量百分数(0.05％-0.1％)半胱氨酸的液体培养基中，于厌氧培养箱(N2:CO2:H2＝80:10:10)中富集12h；

(2)将粪便样品用无菌生理盐水进行梯度稀释后涂布于添加了无菌的100μg/mL莫匹罗星、50U/mL制霉菌素的MRS+质量百分数(0.05％-0.1％)L-半胱氨酸盐酸盐的固体平板上，培养24-48h；

(3)选取符合双歧杆菌基本形态的单菌落进行平板划线纯化，筛选分离出双歧杆菌所选菌株；

(4)将上述单菌落培养于液体MRS+质量百分数(0.05％-0.1％)半胱氨酸培养液中培养24h后进行革兰氏染色，选取革兰氏两歧双歧杆阳性菌进行后续试验。

2、双歧杆菌的初步鉴定：果糖-6-磷酸盐磷酸酮酶测定法

(1)将步骤1所筛选得到的双歧杆菌乳酸菌在液体MRS+质量百分数(0.05％-0.1％)半胱氨酸培养基中培养24h，然后取1mL培养物8000rpm离心2min；

(2)用含0.05％(质量百分数)半胱氨酸的pH 6.5的0.05M KH

(3)重悬于200μL添加了0.25％(质量百分数)Triton X-100的上述磷酸盐缓冲液；

(4)添加50μL浓度为6mg/mL氟化钠和10mg/mL碘乙酸钠的混合液以及50μL浓度为80mg/mL的果糖-6-磷酸，37℃孵育1h；

(5)添加300μL浓度为0.139g/mL、pH 6.5的盐酸轻胺，并于室温放置10min；

(6)分别添加200μL 15％(质量百分数)的三氯乙酸和4M HCl；

(7)添加200μL含有5％(质量百分数)三氯化铁的0.1M HCl，若体系迅速变为红色，即为F6PPK阳性，可初步断定其为双歧杆菌。

3、双歧杆菌的分子生物学鉴定

(1)取步骤2筛选出并且活化3代的菌体(培养12-48h)1mL用于菌种鉴定，6000r/min离心3min，弃上清得菌体。

(2)加入1mL无菌水吹打洗菌体后，10000r/min离心1min，弃上清得菌体，加入500μL无菌水重悬，作为菌液模板。

(3)16S rDNA PCR体系：

A.细菌16S rDNA，20μLPCR反应体系：

27F，0.5μL；1492R，0.5μL；Taq酶，1μL；模板，1μL；ddH20，8μL。

B.PCR条件：

94℃5min；94℃30s；55℃30s；72℃2min；72℃10min；step2-4 30×；12℃2min。

(4)制备1％琼脂糖凝胶，之后将PCR产物与10000×Loading buffer混合，上样量2μL，120V跑30min，然后进行凝胶成像；

(5)将16S rDNA的PCR产物进行测序分析，并将得到的序列结果使用BLAST在GenBank中进行搜索和相似性比对，选取测序结果，结果显示菌株为两歧双歧杆菌，将其命名为两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1165，-80℃保藏备用。

实施例2：两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1165对洛哌丁胺诱导产生便秘相关症状的缓解

具体步骤如下：

(1)两歧双歧杆菌CCFM1165菌悬液的制备

将两歧双歧杆菌CCFM1165菌种于-80℃冰箱取出后，划线于MRS固体培养基中，37℃培养48h，挑取单菌落于MRS液体培养基中，37℃培养24h，制备得到种子液；

将制备得到的种子液以2％(v/v)的接种量接种于新的MRS液体培养基中，于37℃培养24h，按照同样的方式再次培养一代，制备得到两歧双歧杆菌CCFM1165发酵液；

然后将制备得到两歧双歧杆菌CCFM1165发酵液在6000r/min、4℃条件下离心5min，然后用10％的脱脂乳进行重悬，制得菌悬液，用于动物实验。

(2)取6周龄的健康雄性C57BL/6J小鼠25只，适应环境1周，随机分为5组：对照组、模型组、酚酞组、两歧双歧杆菌组(CCFM668)(该菌株公开于“Bifidobacteria exertspecies-specific effects on constipation in BALB/c mice.Food&Function,2017,8(10):3587-3600”的文章中)、两歧双歧杆菌干预组(CCFM1165)，每组含小鼠5只，灌胃菌悬液的剂量为5×10

实验动物分组及处理方法见表3：

表3实验动物分组

在第38天，灌胃结束后，将小鼠单只放入垫有吸水纸的笼盒中，收集粪便，称重即为湿重，冻干后，即为干重，按照如下公式计算粪便含水量。

粪便含水量(％)＝(粪便湿重-粪便干重)/粪便湿重；

在第39天，空白对照组给予0.2mL生理盐水、模型组、酚酞组和灌菌组均给予0.2mL盐酸洛哌丁胺溶液(10mg/kg b.w)，1h后，分别向每组灌胃墨汁，从灌胃墨汁开始，记录每一只小鼠排首粒黑便的时间。

第39天，各组小鼠禁食不禁水过夜。第40天上午9点空白对照组给予0.2mL生理盐水，模型组、酚酞组和灌菌组均给予0.2mL盐酸洛哌丁胺溶液(10mg/kg b.w)，30min后，各组分别灌胃墨汁，30min后处死小鼠，打开腹腔，剪取上端自幽门，下端至盲肠，测量小肠全长为“小肠总长度”，从幽门到墨汁前沿为“墨汁推进长度”，按照以下公式计算小肠推进率。

小肠推进率(％)＝(墨汁推进长度(cm))/(小肠总长度(cm))×100粪便含水量、排首粒黑便时间、小肠推进率实验结果如图1所示，由图1可知，两歧双歧杆菌CCFM1165组相对于便秘模型组，灌胃两歧双歧杆菌CCFM1165能显著增加小肠推进率、增加粪便含水量，其中灌胃两歧双歧杆菌CCFM1165后小肠推进率可达79.45％，比便秘模型组提高了155.38％(P<0.0001)，粪便含水量可达56.74％，比便秘模型组提高了18.5％(P＝0.0028)；灌胃两歧双歧杆菌CCFM1165后在一定程度上缩短排首粒黑便时间(为181min)，比便秘模型组缩短了5.63％。同时与酚酞组(粪便含水量53.84％，小肠推进率44.47％，首粒黑便时间189min)相比，粪便含水量提高了5.39％，小肠推进率提高了78.66％，首粒黑便时间降低了4.23％，表明两歧双歧杆菌CCFM1165的效果明显优于酚酞药物。

且这三种表观指标上，两歧双歧杆菌CCFM1165的作用效果要优于两歧双歧杆菌CCFM668。通过比较发现两歧双歧杆菌CCFM1165对小肠推进率的影响最为显著(P<0.0001)，其粪便含水量与小肠推进率能恢复至与对照组水平相近。综上所述，两歧双歧杆菌CCFM1165从表观指标上凸显出了良好的缓解便秘作用。

实施例3：两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1165可降低便秘小鼠血清中生长抑素(SS)的含量

具体步骤如下：

(1)C57BL/6J小鼠分组、造模及处理方法同实施例2。

(2)第40天处死小鼠后，将收集到的小鼠血液静置2h，3000×g离心15min后获得血清，采用生长抑素(SS)检测试剂盒，根据说明书进行实验，由标准曲线计算出血清中SS的浓度。

有研究表明生长抑素作为一种作用广泛的神经激素，它能够抑制各种胃肠激素的释放，从而抑制胃肠蠕动。

实验结果如图2所示，模型组(生长抑素SS的含量为6.41ng/L)与对照组相比有显著增加(P＝0.0110)，增加了10.56％，CCFM668(生长抑素SS的含量为4.978ng/L)与两歧双歧杆菌CCFM1165组(生长抑素SS的含量为5.027ng/L)都能够显著下调便秘小鼠血清中SS的含量(P<0.0001)。其中，两歧双歧杆菌CCFM1165组的生长抑素SS相对于模型组降低了21.58％；此外，酚酞组(生长抑素的含量为6.106ng/L)，与模型组相比降低了4.74％，而两歧双歧杆菌CCFM1165组比酚酞组降低了17.67％，效果比酚酞药物更为显著。

两歧双歧杆菌CCFM1165能够通过抑制血清中SS的含量来调节便秘所导致的SS含量增高的现象，从而对胃肠激素的抑制作用有明显减弱，促进胃肠蠕动。

实施例4：两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1165可提高便秘小鼠血清中胃动素(MTL)的含量

具体步骤如下

(1)C57BL/6J小鼠分组、造模及处理方法同实施例2。

(2)第40天处死小鼠后，将收集到的小鼠血液静置2h，3000×g离心15min后获得血清，采用小鼠胃动素MTL检测试剂盒，根据说明书进行实验，由标准曲线计算出血清中MTL的浓度。

从文献中可知，胃动素(MTL)是一种由22个氨基酸组成的多肽，能够促进和影响胃肠运动及胃肠道对水、电解质的运输，从而促进胃的收缩与肠道蠕动，属于兴奋型胃肠活性肽。

实验结果如图3所示，从图3中可以看出，模型组(小鼠血清中MTL的含量为219.4ng/L)比对照组的小鼠血清中MTL的含量显著降低(P<0.0001)，降低了46.44％，酚酞组(小鼠血清中MTL的含量为225.6ng/L)，比模型组提高了2.82％，而灌胃两歧双歧杆菌CCFM1165(小鼠血清中MTL的含量为279.9ng/L)能够显著增加便秘小鼠血清中MTL的含量(P＝0.0054)，相对于模型组提高了27.58％，相比于酚酞组提高了24.07％。

这说明两歧双歧杆菌CCFM1165可以通过增加血清中MTL的含量来促进胃肠运动，从而缓解便秘症状。

实施例5：两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1113可提高便秘小鼠结肠组织中血清素(5-HT)及血清素受体4(5-HT4R)的含量

具体步骤如下：

(1)C57BL/6J小鼠分组、造模及处理方法同实施例2。

(2)第40天处死小鼠后，解剖后取出小鼠的结肠组织，将收集到的小鼠结肠组织按1:9(组织重量：PBS)的比例加入预冷的PBS，使用组织破碎仪进行组织研磨，于4℃、12000r/min离心15min，取出上清液。采用血清素(5-HT)检测试剂盒，根据说明书进行实验，由标准曲线计算出结肠组织中血清素(5-HT)的浓度。

(3)血清素(5-HT)主要由肠嗜铬细胞释放，并且通过作用于相应受体才能产生作用。其中，5-HT能够通过作用于5-HT4R，从而激活乙酰胆碱或降钙素基因相关肽，进而增加近端平滑肌的收缩。此外，采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)来测定5-HT4R基因的表达量。

结果如图4所示，模型组(结肠组织中血清素5-HT的含量为37.03ng/mL)与对照组相比，模型组的结肠组织中5-HT的含量存在下降趋势(P＝0.0389)，酚酞组(结肠组织中血清素5-HT的含量为37.14ng/mL)，与模型组相差不大，灌胃两歧双歧杆菌CCFM668后，血清素的含量与模型组的差异不大，为36.46ng/mL，而灌胃两歧双歧杆菌CCFM1165后，结肠组织中5-HT的含量可达38.9ng/mL，与模型组相比，提高了5.1％。

同样，对于空白小鼠来说，5-HT4R基因的表达量也存在显著增加(P<0.0001)。灌胃两歧双歧杆菌CCFM1165后，5-HT4R基因的表达存在上升的趋势，5-HT4R基因的相对表达量为2.311，与模型组(5-HT4R基因的表达量为0.6687)相比，提高了245.6％，与酚酞组(5-HT4R基因的表达量为0.5913)相比，提高了290.8％。

因此，从结果中可以发现，两歧双歧杆菌CCFM1165能够通过增加结肠组织中5-HT的含量，促进5-HT4R基因的表达来推进肠道蠕动，从而缓解便秘。

实施例6：两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1165提高便秘小鼠结肠组织中水通道蛋白8(AQP8)表达量

具体步骤如下：

(1)C57BL/6J小鼠分组、造模及处理方法同实施例2。水通道蛋白(AQP)是指一类可以高效选择性转运水分子的细胞膜通道蛋白，其中，AQP8主要参与空肠和结肠大量水分子的转运，AQP8表达的异常会导致水分的过度吸收及肠液分泌的减少。

(2)采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)来测定介导肠道分泌的AQP8的表达量。实验结果如图5所示，由图5可知，灌胃洛哌丁胺后，与对照组小鼠相比，模型组小鼠的AQP8相对表达量(相对表达量为1.256)显著上升4.09倍，模型组与对照组相比，增加了409％(P＝0.0004)，说明便秘模型小鼠结肠中AQP8表达量的增加使结肠部分对粪便水分的吸收有明显增加。同时，酚酞组小鼠的AQP8相对表达量(相对表达量为0.9559)与模型组相比，降低了23.89％，是具有一定抑制作用。

但灌胃两歧双歧杆菌CCFM1165后，其肠道中AQP8基因相对表达量(相对表达量为0.4225)较模型组降低了1.97倍，与模型组相比，降低了197％(P＝0.0033)，比酚酞组的治疗效果更加显著。

因此，从结果中可以看出两歧双歧杆菌CCFM1165能够通过降低结肠组织中AQP8的表达量来减少结肠对粪便中水分的过度吸收，从而避免粪便硬结，缓解便秘症状。

实施例7：两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1165提高便秘小鼠盲肠内容物粪便中短链脂肪酸含量

具体步骤如下：

C57BL/6J小鼠分组、造模及处理方法同实施例2。

将实验结束前所收集的盲肠内容物粪便进行冷冻干燥，利用GC-MS测定小鼠冻干盲肠内容物粪便中的短链脂肪酸含量。从而计算出各种短链脂肪酸各种短链脂肪酸的浓度。

实验结果如图6所示，用洛哌丁胺造模后，模型组小鼠盲肠内容物中乙酸、丁酸与丙酸的含量与对照组相比都有一定程度的降低，其中模型组乙酸含量为73.79μmol/g，丁酸含量为15.59μmol/g，丙酸含量为17.74μmol/g，分别比空白组下降了40.49％、29.8％与26.14％(P

因此，两歧双歧杆菌CCFM1165对于提高盲肠内容物中短链脂肪酸含量的效果非常显著，能够通过增加盲肠中乙酸、丁酸与丙酸的含量来缓解便秘。

实施例8：两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1165降低便秘所导致的结肠组织病理损伤

具体步骤如下：

(1)C57BL/6J小鼠分组、造模及处理方法同实施例2。

(2)小鼠解剖后取新鲜组织放入多聚甲醛固定液，浸泡后，过夜冲洗。将样品依次经70％、80％、90％各级乙醇溶液脱水，各30min，再放入95％、100％各2次，每次20min进行脱水。放入1/2纯酒精，1/2二甲苯等量混合液15min，二甲苯前洗液15min、二甲苯后洗液15min至透明为止。放入二甲苯和石蜡各半的混合液15min，再放入石蜡Ⅰ、石蜡Ⅱ透蜡各50-60分钟来除去透明剂。将处理好的样品进行包埋切片、展片、烤片、H&E染色与封片。

观察小鼠结肠组织的病理切片，如图7所示，模型组与对照组相比，模型组小鼠的结肠组织存在黏液层变薄，隐窝结构缩短，杯状细胞减少，并且存在炎症浸润的现象。但是灌胃两歧双歧杆菌CCFM1165后，小鼠结肠组织中的黏液层变厚，杯状细胞的界限更加清晰明了，同时平滑肌结构也较为完整。而灌胃酚酞药物与两歧双歧杆菌CCFM668后，小鼠的黏液层厚度增加，但增加的程度不如CCFM1165，杯状细胞与隐窝结构更加清晰，炎症浸润的情况也有所减少。

因此，从结果中可以看出，两歧双歧杆菌CCFM1165能够缓解便秘所导致的结肠病理损伤。

实施例9：两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1165提高显著小鼠粪便中双歧杆菌属的丰度

具体步骤如下：

(1)C57BL/6J小鼠分组、造模及处理方法同实施例2。

(2)将下机数据进行分析后，如图8所示，模型组与酚酞组小鼠粪便中几乎不存在双歧杆菌属，而对照组与灌菌组小鼠粪便中双歧杆菌属的丰度较高，其中空白组丰度为0.6349％，CCFM668组丰度为0.7297％，CCFM1165组的丰度为0.9948％。灌胃两歧双歧杆菌CCFM1165后，双歧杆菌属的丰度有显著上升(P＝0.0055)。因此，两歧双歧杆菌CCFM1165的干预对于增加双歧杆菌属丰度有着显著作用，能够通过弥补便秘小鼠所缺失的双歧杆菌属来调节肠道菌群，维持肠道菌群的稳态，从而缓解便秘。

实施例10：两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1165能够比GDMCCNO.60939更好地增加血清中MTL的含量，促进结肠组织中5-HT的分泌，且对小肠蠕动的推进作用更为显著

将动物实验中CCFM1165与GDMCC NO.60939菌株的结果与其模型组进行归一化后进行比较(造模及动物处理方法同实施例2，且MTL、5-HT与小肠推进率的测定方法完全相同)，结果如表4所示：

表4 CCFM1165与GDMCC NO.60939菌株的结果比较

从结果可以看出，两歧双歧杆菌CCFM1165比GDMCC NO.60939更能显著提高血清中MTL的含量，提高结肠组织中5-HT的含量，从而对胃的收缩、胃液的分泌、肠道肌肉的收缩有显著的影响，提高小肠推进率，从而对肠道蠕动有更好的作用效果，有效缓解便秘。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。