用于肝癌患者抗肿瘤免疫应答的个体化的可视化展示方法

摘要

本发明公开一种用于肝癌患者抗肿瘤免疫应答的个体化的可视化展示方法，其包括：采集肿瘤组织及与其匹配的血细胞样本，分离出肿瘤组织DNA和RNA、血细胞DNA；对肿瘤组织RNA进行全转录组测序，得到全转录组测序数据；根据全转录组测序数据对七个免疫循环参数进行评估；对肿瘤组织DNA和血细胞DNA进行全外显子测序，得到全外显子测序数据；根据全外显子测序数据和全转录组测序数据，预测肿瘤新生抗原负荷；通过八个维度的基因参数表示抗肿瘤免疫循环，并对八个维度的基因参数进行可视化展示，其中八个维度的基因参数包括：T细胞免疫、肿瘤新生抗原负荷、致敏及活化、趋化及浸润、识别肿瘤细胞、抑制细胞、免疫检查点分子表达和抑制分子表达。

说明书

技术领域

本发明涉及肿瘤免疫技术领域，尤其涉及一种用于肝癌患者抗肿瘤免疫应答的个体化的可视化展示方法。

背景技术

肝癌是一种常见的恶性肿瘤，其病死率在所有恶性肿瘤中位居第二，严重威胁人们的生命和健康。肝癌常见的治疗方案手术治疗、靶向治疗、经导管动脉化疗栓塞和消融等治疗对晚期肝癌的治疗效果非常有限。

近年来，免疫治疗的出现给肝癌的治疗提供了新的选择，细胞免疫治疗、细胞因子、肿瘤疫苗、溶瘤病毒以及免疫检查点抑制剂等新兴的免疫治疗技术也逐步往临床应用上推进，但是总体治疗应答率仍非常有限。

由于肝癌患者免疫微环境异质性较强，不同肝癌患者免疫微环境个体差异很大，建立个体化评估肝癌免疫微环境特征，细分不同免疫治疗方案的适应症人群，对提高肝癌的整体治疗应答率尤为重要。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种用于肝癌患者抗肿瘤免疫应答的个体化的可视化展示方法，以解决缺乏肝癌患者的抗肿瘤免疫应答的个体化的可视化评估方法的问题。

根据本发明实施例的用于肝癌患者抗肿瘤免疫应答的个体化的可视化展示方法包括：采集肿瘤组织及与其匹配的血细胞样本，分离出肿瘤组织DNA和RNA、血细胞DNA；对肿瘤组织RNA进行全转录组测序，得到全转录组测序数据；根据所述全转录组测序数据对以下七个免疫循环参数进行评估，所述七个免疫循环参数包括：T细胞免疫、致敏及活化、趋化及浸润、识别肿瘤细胞、抑制细胞、免疫检查点分子表达和抑制分子表达；对所述肿瘤组织DNA和所述血细胞DNA进行全外显子测序，得到全外显子测序数据；根据所述全外显子测序数据和所述全转录组测序数据，预测肿瘤新生抗原负荷；通过八个维度的基因参数表示抗肿瘤免疫循环，并对所述八个维度的基因参数进行可视化展示，其中所述八个维度的基因参数包括：T细胞免疫、肿瘤新生抗原负荷、致敏及活化、趋化及浸润、识别肿瘤细胞、抑制细胞、免疫检查点分子表达和抑制分子表达。

其中，采用雷达图可视化展示所述八个维度的基因参数。

其中，在所述雷达图中以逆时针顺序展示所述八个维度的基因参数。

其中，所述根据所述全外显子测序数据和所述全转录组测序数据预测肿瘤新生抗原负荷的步骤，包括：对所述全外显子测序数据进行HLA分型处理得到HLA分型结果；根据所述全外显子测序数据和所述全转录组测序数据鉴定出样本中的突变型抗原肽；对所述突变型抗原肽与其匹配的HLA分子的亲和力进行分析，预测肿瘤新生抗原负荷。

其中，所述对所述全外显子测序数据进行HLA分型处理的步骤，包括：选择6号染色体HLA分子全外显子测序数据，对HLA I型基因进行分型处理，并对得到的HLA分型结果进行确认分析。

其中，对所述突变型的抗原肽其匹配的HLA分子的亲和力进行分析的步骤，包括：计算突变型抗原肽的基因表达值，所述基因表达值大于预设值的突变型抗原肽为新生抗原负荷。

其中，所述预设值为1.6TPM。

其中，所述根据所述全转录组测序数据对以下七个免疫循环参数进行评估的步骤，包括：按照人类基因组进行序列比对，对所述肿瘤组织RNA的转录组进行组装，计算基因表达量TPM值，采用基因集变异分析对所述七个免疫循环参数进行评估。

根据本发明的技术方案，能够将肝癌患者抗肿瘤免疫应答以个体化、可视化方法展示，有助于为特定免疫状态的肝癌患者制定个体化的免疫治疗策略，对提高肝癌总体疗效具有重要理论和实践意义。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1是根据本发明实施例的可视化展示方法的流程图；

图2是根据本发明实施例的肿瘤免疫循环的雷达图显示的示意图；

图3A是根据本发明实施例的冷肿瘤及热肿瘤免疫循环肝癌患者无疾病生存率(DFS,disease-free survival)KM生存分析曲线的示意图；

图3B是根据本发明实施例的冷肿瘤及热肿瘤免疫循环肝癌患者总体生存率(OS,Overal survival)KM生存分析曲线的示意图；

图4是根据本发明实施例的肝癌冷肿瘤免疫循环的示意图；

图5是根据本发明实施例的肝癌热肿瘤免疫循环的示意图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明具体实施例及相应的附图对本发明技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

以下结合附图，详细说明本发明各实施例提供的技术方案。

现有技术中，根据肿瘤微环境中免疫细胞浸润将肿瘤免疫微环境分为三种：(1)免疫炎症型(inflamed)：肿瘤周围有较多的免疫细胞浸润，但其中一部分免疫细胞功能是被抑制的；(2)免疫阻隔型肿瘤(Immune excluded)：肿瘤相关成纤维细胞及胞外基质所形成的致密的基质屏障阻隔免疫细胞浸润到肿瘤细胞周围，肿瘤中缺乏肿瘤浸润淋巴细胞；(3)免疫沙漠型(Immune desert)：免疫细胞远离肿瘤细胞，微环境几乎没有免疫细胞浸润。炎症型肿瘤对于免疫检查点抑制剂治疗敏感，免疫阻隔型肿瘤和免疫沙漠型肿瘤对免疫检查点药物治疗应答率很低。上述基于免疫细胞浸润的肿瘤免疫分型在不同肿瘤中普遍存在。以上的免疫微环境分型主要是依据免疫细胞浸润特征，在临床实践工作中，个体化的免疫治疗策略的制定需要基于对每一位肿瘤患者免疫应答特征更为全面的整合分析评估，而且对复杂的免疫特征如果能通过个体化、可视化的呈现方式将更加有助于制定诊疗方案。

随着近年肿瘤免疫学理论发展及新技术的突破，基于“肿瘤免疫循环”的理论，并结合免疫多组学研究手段，使得整体评估并可视化展示实体瘤的免疫微环境成为可能。

参考图1，根据本发明实施例的用于肝癌患者抗肿瘤免疫应答的个体化的可视化展示方法，包括以下步骤：

步骤S102，采集肝癌患者的肿瘤组织及与其匹配的血细胞样本，

步骤S104，分离出肿瘤组织RNA；

步骤S106，对肿瘤组织RNA进行全转录组测序，得到全转录组测序数据；

步骤S108，根据所述全转录组测序数据对以下七个免疫循环参数进行评估，所述七个免疫循环参数包括：T细胞免疫、致敏及活化、趋化及浸润、识别肿瘤细胞、抑制细胞、免疫检查点分子表达和抑制分子表达；

具体地，对肿瘤组织的全转录组测序数据，根据标准分析流程，可采用HISAT2软件(版本号：v2.0.4)按照人类基因组(hg19)进行序列比对，采用StringTie软件(版本号：v1.2.3)转录组组装，计算基因表达量TPM值(Transcripts Per Million)，采用R软件(版本号:3.6.1)，R.GSVA软件包，采用基因集变异分析(GSVA,Gene Set Variation Analysis)对免疫循环参数进行评估，包括：T细胞免疫(IGS1)，致敏及活化(ICS3)，趋化及浸润(IGS4)，识别肿瘤细胞(IGS5)，抑制细胞(IGS6)，免疫检查点分子表达(IGS7)，抑制分子表达(IGS8)，包括的基因集参考表1所示。

步骤S110，分离肿瘤组织DNA及血细胞DNA；

步骤S112，对所述肿瘤组织DNA和所述血细胞DNA进行全外显子测序，得到全外显子测序数据；

步骤S114，根据所述全外显子测序数据和所述全转录组测序数据，预测肿瘤新生抗原负荷；

采用肿瘤组织和血细胞DNA匹配的全外显子测序数据，预测新抗原可包括：肿瘤-正常组织配对后突变蛋白鉴定、HLA分型、预测新抗原-MHC结合亲和力。

基因变异分析及突变蛋白鉴定：对肿瘤组织及匹配的血细胞DNA样本全外显子测序原始数据进行质控和筛选，去除测序的接头序列和低质量片段，对高质量的测序数据采用BWA-MEM(bwa-0.7.15)分析软件，按照人类基因参考数据库(hg19)进行序列对比。采用Samtools分析工具将SAM数据文件转换为BAM数据文件。

采用GATK分析工具对BAM数据文件进行基因变异分析，具体分析可参考标准分析流程进行。

HLA分型：对血细胞DNA样本全外显子测序数据，选择6号染色体HLA分子全外显子测序数据，参考HLA参考公共数据库IMGT/HLA，采用Opitype软件对对HLA I型基因进行分型，采用HLA-VBseq工具进一步对HLA分型结果进行确认分析。

预测新抗原-MHC结合亲和力：采用NetMHCpan-3.0软件算法对抗原肽与HLA分子的亲和力进行预测。候选抗原肽段：MHC结合的肽段一般为8-11个氨基酸。NetMHCpan-3.0软件可以提取8-11氨基酸的抗原肽序列，预测抗原肽与其HLA分子的亲和力，其中，亲和力采用IC50参数表示，筛选IC50<500nM，基因表达值大于1.6TPM的抗原肽为新抗原负荷。

步骤S116，通过八个维度的基因参数表示抗肿瘤免疫循环，并对所述八个维度的基因参数进行可视化展示，其中所述八个维度的基因参数包括：T细胞免疫、肿瘤新生抗原负荷、致敏及活化、趋化及浸润、识别肿瘤细胞、抑制细胞、免疫检查点分子表达和抑制分子表达。

其中，参考图2，可采用雷达图可视化展示所述八个维度的基因参数。并且在图2所示的雷达图中，以逆时针顺序展示所述八个维度的基因参数。

表1免疫循环基因集(ICS1,IGS3-IGS8)

结合参考图3-图5，通过整合肿瘤公共数据库(TCGA)，得到337例肝癌全外显子及转录组测序数据，采用根据本申请实施例的雷达图的可视化展示方式对免疫循环的八个维度进行可视化展示。研究表明肝癌免疫循环可以分为两型，将免疫循环参数评分低的命名为“冷肿瘤免疫循环”，将免疫循环参数评分高的命名为“热肿瘤免疫循环”。结果表明，不同肿瘤免疫循环的肝癌患者预后显著不同，热肿瘤免疫循环的肝癌患者较冷肿瘤免疫循环总体生存期及无疾病进展期延长。

以上所述仅为本发明的实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的权利要求范围之内。