基于split-HRV 3C蛋白酶的蛋白相互作用检测方法

摘要

本发明涉及一种基于split‑HRV 3C蛋白酶‑E.coli ClpXP系统的蛋白相互作用检测方法，原理为：由于ClpXP‑SsrA降解途径的存在，融合sfGFP‑HRV 3C蛋白酶底物多肽‑SsrA的融合蛋白可被大肠杆菌ClpXP复合物识别，导致sfGFP的降解，呈现低强度绿色荧光。将捕获蛋白和诱饵蛋白分别融合在的split‑HRV 3C蛋白酶的N端和C端结构域，当捕获蛋白和诱饵蛋白发生相互作用时，N端和C端HRV 3C蛋白酶融合形成具有完整功能的HRV 3C蛋白酶，对相应底物多肽切割识别，导致sfGFP的积累和荧光强度的提升。本发明通过对ClpXP‑SsrA降解机器，sfGFP和split‑HRV 3C蛋白酶的整合，根据绿色荧光强弱，可在宽阔温度范围内，高效灵敏的检测蛋白‑蛋白相互作用。

说明书

技术领域

本发明涉及蛋白相互作用研究领域，具体涉及一种基于split-HRV 3C蛋白酶的蛋白相互作用检测方法。

背景技术

研究蛋白质相互作用对于理解生物体内新陈代谢过程以及所涉及到的蛋白质功能有着至关重要的生物学意义。现如今，已经发展了许多用于研究蛋白质相互作用的方法，比如：细菌/酵母双杂交技术,免疫共沉淀技术(Co-IP)，GST pull down技术，split-蛋白互补技术等等。酵母双杂交技术的特点在于敏感、高效、操作简易可大规模的进行验证，在实际应用当中，由于酵母双杂交的敏感性而伴随着一定的假阳性，同时由于反应发生在细胞核内，所以也并非适用于所有的蛋白质。同时Co-IP使用免疫标签会有假阳性互作，GSTpull down需要体外表达纯化蛋白，也有一定的局限性。

发明内容

本发明的目的是针对上述问题提供一种基于大肠杆菌ClpXP降解机器(SPEC)的利用split-HRV 3C蛋白酶的蛋白相互作用检测方法。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

基于split-HRV 3C蛋白酶的蛋白相互作用检测方法，包括以下步骤：

步骤1、将超折叠绿色荧光蛋白sfGFP融合在HRV 3C蛋白酶底物序列LEVLFQ↓GP的N端,将SsrA降解标签融合在HRV 3C蛋白酶底物序列的C端，得到HRV 3C蛋白酶底物多肽sfGFP-LEVLFQGP-SsrA；

步骤2、将sfGFP-LEVLFQGP-SsrA整合到大肠杆菌的染色体上，得到大肠杆菌重组菌株；

步骤3、将HRV 3C蛋白酶拆分为N端HRV 3C蛋白酶结构域和C端HRV 3C蛋白酶结构域，将捕获蛋白融合到N端HRV 3C蛋白酶结构域，得到第一重组蛋白；将诱饵蛋白融合到C端HRV 3C蛋白酶结构域，得到第二重组蛋白；

步骤4、将第一重组蛋白和第二重组蛋白转入大肠杆菌重组菌株中共表达，利用流式细胞仪检测重组大肠杆菌细胞的绿色荧光信号，若检测到有绿色荧光信号，则说明捕获蛋白和诱饵蛋白之间存在相互作用，若检测到没有绿色荧光信号，则说明捕获蛋白和诱饵蛋白之间不存在相互作用。

进一步的，所述步骤2中HRV 3C蛋白酶的切割位点为K82位点。

进一步的，所述SsrA降解标签可被大肠杆菌内源性ClpXP降解复合物所识别，从而导致SsrA的N端融合的蛋白降解。

进一步的，所述HRV 3C蛋白酶底物N端融合有sfGFP,C端融合有SsrA降解标签；所述HRV 3C蛋白酶底物多肽为sfGFP-LEVLFQGP-SsrA。

进一步的，所述捕获蛋白和诱饵蛋白为待研究相互作用的目的蛋白对；所述捕获蛋白融合在N端HRV 3C蛋白酶结构域，诱饵蛋白融合在C端HRV 3C蛋白酶结构域。

进一步的，所述捕获蛋白和诱饵蛋白发生相互作用时，N端和C端HRV 3C蛋白酶融合形成具有完整功能的HRV 3C蛋白酶，对相应底物多肽切割识别，导致sfGFP信号的积累和细胞荧光强度的提升。

所述的基于split-HRV 3C蛋白酶的蛋白相互作用检测方法，所述sfGFP信号可以通过流式细胞仪检测。

一种split-HRV 3C蛋白酶-E.coli ClpXP系统在检测蛋白是否相互作用和相互作用强度中的应用，所述split-HRV 3C蛋白酶-E.coli ClpXP系统结合了ClpXP-SsrA降解机器，sfGFP和split-HRV 3C蛋白酶的功能。

一种大肠杆菌重组菌株制备方法，包括以下步骤：步骤1、将超折叠绿色荧光蛋白sfGFP融合在HRV 3C蛋白酶底物序列LEVLFQ↓GP的N端,将SsrA降解标签融合在HRV 3C蛋白酶底物序列的C端，得到HRV 3C蛋白酶底物多肽sfGFP-LEVLFQGP-SsrA；

步骤2、将sfGFP-LEVLFQGP-SsrA整合到大肠杆菌的染色体上，得到大肠杆菌重组菌株；

由权利要求上述方法制备得到的大肠杆菌重组菌株在检测蛋白是否相互作用和相互作用强度中的应用

本发明的有益效果为：

1、本发明中的SPEC系统通过ClpXP-SsrA降解机器，sfGFP和split-HRV 3C蛋白酶的整合，将蛋白酶水解信号和绿色荧光信号进行了二级级联放大，提升了灵敏度；

2、本发明中的SPEC系统选用的HRV 3C蛋白酶拥有更强的活性，HRV 3C蛋白酶在SPEC系统中工作时，其活性是TEV蛋白酶的四倍，可以发挥更好的灵敏性；并且有更强的温度适用范围(18-37℃)，在18-37℃下都具备良好的活性；

3、本发明中的SPEC系统采用流式细胞仪用于检测蛋白-蛋白相互作用，以及大肠杆菌作为操作宿主，操作简易。

附图说明

图1为本发明的方法原理示意图；

图2为HRV 3C蛋白酶的结构示意图；

图3为载体SPEC-VA,SPEC-VB,SPEC-VD,SPEC-VE的质粒图谱；

图4为在不同温度范围(37,30,25和18℃)下，HRV 3C蛋白酶和TEV蛋白酶的对比测试结果；

图5为目标蛋白对分别为来源于运动发酵单胞菌的Cas1/Cas2-3和来源于酿酒酵母的Yae1/Lto1时,三个不同split位置(k82,L94,N107)的split-HRV 3C蛋白酶在BL21(DE3)中的流式检测结果；

图6为目标蛋白对为来源于运动发酵单胞菌的Cas1/Cas2-3时，在不同温度范围(37,30,25和18℃)下，split-HRV 3C蛋白酶和split-TEV蛋白酶分别在BL21(DE3)中的对比测试结果；

图7为目标蛋白对为来源于酿酒酵母的Yae1/Lto1时，在不同温度范围(37,30,25和18℃)下，split-HRV 3C蛋白酶和split-TEV蛋白酶分别在BL21(DE3)中的对比测试结果；

图8为sfGFP-LEVLFQGP-SsrA片段整合到大肠杆菌染色体上的实验流程图和重组菌株BL21(DE3)-SPEC的验证结果；

图9为目标蛋白对分别为运动发酵单胞菌Cas1/Cas2-3和酿酒酵母Yae1/Lto1时,在不同温度(37,30,25和18℃)下，split-HRV 3C蛋白酶在重组菌株BL21(DE3)-SPEC中的对比测试结果；

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

本发明建立了一种全新的研究蛋白-蛋白相互作用的技术——split HRV 3Cprotease-E.coli ClpXP(SPEC，基于大肠杆菌ClpXP降解机器的split-HRV 3C蛋白酶系统)。如图1所示，首先，sfGFP(super-fold green fluorescence protein,超折叠绿色荧光蛋白)被融合在HRV 3C蛋白酶底物序列(LEVLFQ↓GP)的N端,HRV 3C蛋白酶底物序列的C端融合了SsrA降解标签序列(AANDENYALAA)，形成了一个sfGFP-LEVLFQ↓GP-SsrA盒式结构。与此同时，HRV 3C protease(Human rhinovirus protease,人鼻病毒3C蛋白酶)和TEVprotease(Tobacco etch virus protease,烟草蚀纹病毒蛋白酶)都是拥有高度蛋白水解活性和强底物特异性的病毒来源的蛋白酶，因此都是用于SPEC系统蛋白酶的良好选择。相比于TEV蛋白酶,HRV 3C蛋白酶具有更快的切割能力以及在低温度范围(4℃to 37℃)内能维持高活性的能力，引用于[Raran-Kurussi,S.,

实施例1

分别用以表达HRV 3C蛋白酶底物多肽和野生型HRV 3C蛋白酶的载体SPEC-VA和SPEC-VB的构建过程以及野生型HRV 3C蛋白酶和野生型TEV蛋白酶的工作效果对比

(1)首先通过聚合酶链式反应(PCR)扩增得到sfGFP-LEVLFQGP-SsrA和HRV 3C蛋白酶两个目的基因，反应体系如下：50μL体系，10×KOD buffer，5μL；dNTP(2.5mM)，3μL；正向引物(10μM)，2μL；反向引物(10μM)，2μL；Pfu高温DNA聚合酶，1μL；模板(含sfGFP-LEVLFQGP-SsrA序列)，0.5μL(20ng/μL)；加双蒸水至50μL。

PCR扩增条件：95℃，5min；95℃，30s，57℃，30s，72℃，30s，25个循环；72℃，5min；12℃，10min。

引物设计如下：

T7-FP:GCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGATGGTGAGCAAGGGCGAG

T7-RP:CTTGTCGACGGAGCTCGAATTCGGATCCGGCTGCCAAAGCATAGTTTTC

1928-HRV3C-Fwd:GTGCCGCGCGGCAGCCATATGGCTAGCGGTCCAAATACTGAATTTGC

1928-HRV3C-Rvs:CTTGTCGACGGAGCTCGAATTCGGATCCTCAAGAACCTTGCTTTTCAAC

(2)琼脂糖凝胶回收得到目的片段，分别用NdeI，BamHI在37℃下，双酶切5hr，再用琼脂糖凝胶回收，双酶切体系：目的片段DNA，30μL；10×Cutsmart Buffer，5μL；NdeI，BamHI各2μL；加双蒸水至50μL。

(3)以同样的体系分别酶切载体p1928并回收，22℃酶连载体和目的片段2h，酶连反应体系：载体，1.2μL；目的片段，0.5μL；T4 DNA Ligase，0.2μL(Thermo Fisher)，10×T4Ligase Buffer，2μL；加双蒸水至20μL。

(4)转化，取5μL酶连产物于50μL XL-glod感受态中，冰上静置10min后42℃热激45s，加LB培养基于37℃，250rpm摇床内培养1h后，涂布Amp抗性平板。

(5)各挑2个经过菌落PCR鉴定的重组子测序，得到正确重组的HRV 3C蛋白酶底物表达载体SPEC-VA和野生型HRV 3C蛋白酶表达载体SPEC-VB(如图3所示)。

(6)分别将表达野生型HRV 3C蛋白酶和野生型TEV蛋白酶的载体和相应的底物表达载体共转化大肠杆菌BL21(DE3)表达宿主里，涂布于含有卡那霉素(终浓度100μg/mL)和氨苄青霉素(50μg/mL)的LB双抗平板，置于37℃培养箱培养12-16h。LB固体培养基成分为5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，10g/L氯化钠,15g/L琼脂。

接种单菌落于含有卡那霉素(终浓度100μg/mL)和氨苄青霉素(50μg/mL)的液体LB培养基中。37℃，220rpm摇床中培养至OD600＝0.6，然后在不同温度(37,30,25和18℃)下，0.5mM终浓度IPTG下进行诱导，分时间段取样(100μL/次)，离心去上清，再用150μL 1x PBS洗涤两次后，并用400μL重悬。重悬的细胞用于CytoFLEX流式细胞仪分析，检测的荧光信号通道是FITC(BP 525/40nm)，测定样品细胞的平均荧光强度，对比在不同温度(37,30,25和18℃)下检测野生型HRV 3C蛋白酶和野生型TEV蛋白酶的工作效果，如图4所示，结果显示HRV 3C蛋白酶活性是TEV蛋白酶活性近4倍，HRV 3C蛋白酶在18-37℃下均能呈现很好的活性，分别在4,6,10和20h IPTG诱导下，呈现最强绿色荧光蛋白表达水平；但是TEV蛋白酶在18-30℃下活性呈现下降的趋势，说明相比于TEV蛋白酶，HRV 3C蛋白酶具备更宽阔的温度范围适应能力。

实施例2

不同split位置的split-HRV 3C蛋白酶载体的构建过程以及split-HRV 3C蛋白酶和split-TEV蛋白酶在不同温度范围下的工作效果对比

分析HRV 3C蛋白酶的三维结构，找到三个可能的split位点(K92,L94,N107),分别位于随机螺旋和β-折叠片后面，然后按照实施例1中的载体构建方式，分别构建K92,L94,N107三个split位置的split-HRV 3C蛋白酶载体；选取的目标蛋白对为来源于运动发酵单胞菌的Cas1/Cas2-3和来源于酿酒酵母的Yae1/Lto1。

引物设计如下：

NC-FP1:GATTACGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGTTGACAATTAATCATCGGCTCG

NC-RP1:CATACATCGTCCCAAGTATTCGACATGAATTCAATCTATGGTCCTTG

NC-FP2:CAAGGACCATAGATTGAATTCATGTCGAATACTTGGGACGATGTATGGGC

NC-RP2:GCTCCCGCCGCCACCACTACCACCGCCTCCTTGGATAGATGGCACATGG

NC-FP3:GTAGTGGTGGCGGCGGGAGCGGTCCAAATACTGAATTTGC

NC-RP3:CGTTTTATTTGAGATCTTCACTTTTCATTGCGATCCAAAGTCAATAC

NC-FP4:GTGAAGATCTCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTG

NC-RP4:GTAAAACGACGGCCAGTGAATTCGAGCTCAAGAGTTTGTAGAAACGC

NC-FP5:GATTACGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGTTGACAATTAATCATCGGCTCG

NC-RP5:GTAAATTATCAAAATCCTCGAGAATCTATGGTCC

NC-FP6:GACCATAGATTCTCGAGATGGATTTTGATAATTTACTAAACC

NC-RP6:GCTCCCGCCGCCACCACTACCACCGCCTCCCCAGGATTGAGCCTGATTTTG

NC-FP7:GGTAGTGGTGGCGGCGGGAGCTTTCGTGATATTCGTGGTTTC

NC-RP7:GAGCCTTTCGTTTTATTTGGGATCCTCAAGAACCTTGCTTTTC

NC-FP8:CAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGC

NC-RP8:GTAAAACGACGGCCAGTGAATTCGAGCTCAAGAGTTTGTAGAAACGC

CAS1-F:CACCAACAAGGACCATAGATTGAATTCATGAAGCCAATAACATCGG

CAS1-R:GCTCCCGCCGCCACCACTACCACCGCCTCCTCATAATGCAGGCTCGGCCTCC

CAS2-F:CAAGGACCATAGATTCTCGAGATGAGTATGTTGGTCGTGG

CAS2-R:GCTCCCGCCGCCACCACTACCACCGCCTCCTCAAACAGGTAAAAAAGAC

94N-R:CTTTCGTTTTATTTGAGATCTTCACAAATCTTCAGAAATGAAAC

94C-F:GTAGTGGTGGCGGCGGGAGCGAAGGTGTTGATGCTACTTTGG

107N-R:CTTTCGTTTTATTTGAGATCTTCAATTGTTAGAATGAACAACCAAAG

107C-F:GTAGTGGTGGCGGCGGGAGCTTTACTAATACTATTTTAGAAG

将构建好的K92,L94,N107三个split位置的split-HRV 3C蛋白酶重组载体和HRV3C蛋白酶底物表达载体按实施例1中所述方法分别共转化大肠杆菌BL21(DE3)表达宿主，按实施例1中所述方法进行诱导表达后，取样使用CytoFLEX流式细胞仪检测，结果显示K82,L94,N107三个split位置的split-HRV 3C蛋白酶均能重新组装形成具有完整功能活性的HRV 3C蛋白酶，如图5所示，其中K82为最佳split位置，表达split-HRV 3C(K82)蛋白酶的85-97％细胞呈现出绿色荧光，接近于野生型HRV 3C蛋白酶(98％的绿色荧光细胞)。

选取split-TEV蛋白酶作为对照，对比测试split-HRV 3C(K82)蛋白酶和split-TEV蛋白酶的工作效果，如图6-图7所示，在同样包含不同的强相互作用蛋白对(来源于原核生物运动发酵单胞菌的Cas1/Cas2-3和来源于真核生物酿酒酵母的Yae1/Lto1)，在不同温度(37,30,25和18℃)下，在SPEC系统中，split-HRV 3C(K82)蛋白酶均比split-TEV蛋白酶发挥出更好的工作效果；同样值得注意的是，在30,25和18℃下，重组的split-HRV 3C(K82)蛋白酶呈现的最高绿色荧光蛋白表达水平是重组split-TEV蛋白酶的四倍多，这证明split-HRV 3C(K82)蛋白酶在宽阔温度范围内具有高度灵敏性。

实施例3

BL21(DE3)-SPEC重组菌株的构建过程

为了简化SPEC系统的操作以及增加SPEC系统的稳定性，采用CRISPR/Cas9耦联λ-red重组技术，将sfGFP-LEVLFQGP-SsrA底物片段整合到大肠杆菌BL21(DE3)染色体上。整合过程中，需要构建pKD46-cas9-gRNA温敏型载体和制备目的片段LpxM-L--sfGFP-LEVLFQGP-SsrA--LpxM-R。

引物设计如下：

1.扩增cas9和退火得到gRNA

CAS9-F:GATATACCATGGATAAGAAATACTCAATAGGCTTAGATATCGGCAC

CAS9-R:CCATCACCTTCCTCTTCTTCTTGGGGTCACCTCCTAGCTGACTCA

gRNA1:CGTCTGCATGCGAGAAATGA

gRNA3:CAGCATGGCAGGAATATCGA

2.扩增LpxM-L—sfGFP，sfGFP-LEVLFQGP-SsrA和SsrA--LpxM-R,再融合扩增得到完整的目的片段LpxM-L--sfGFP-LEVLFQGP-SsrA--LpxM-R

LSR-1F:GGGACGCGCAAGCTTCTCGAGATGGAAACGAAAAAAAATAATAG

LSR-1R:GACTGAGCTAGCCGTAAACCATTTTCTGCCCTTGCGA

Sfgfp-F:TTTACGGCTAGCTCAGTCCTAGGTACAATGCTAGCATGGTGAGCAAGGGCG

Sfgfp-R:

CATCGTTAGCTGCTGGTCCTTGGAATAGGACTTCAAGCTTGTACAGCTCGTCC

LSR-2F:

GGACCAGCAGCTAACGATGAAAACTATGCTTTGGCAGCCCAGCGATGTTCCATAA

LSR-2R:GAAAACTGTCCATACCCATGGCTCGAGTTATTTGATGGGATAAAGATC

如图8所示，将扩增得到的目的片段LpxM-L--sfGFP-LEVLFQGP-SsrA--LpxM-R和pKD46-cas9-gRNA共转化大肠杆菌BL21(DE3)，涂布于LA平板，30℃下培养，同时选取pKD46-cas9，pKD46-cas9-gRNA作为对照，cas9-gRNA发挥编辑作用时，含有cas9-gRNA的细胞将因为基因组被破坏致死，含有cas9-gRNA的细胞将生长正常，同时将共转化cas9-gRNA和目的片段的大肠杆菌细胞，存活下来的转化子进行菌落PCR检测和测序分析，筛选正确的转化子(基因组上lpxM位点插入了sfGFP-LEVLFQGP-SsrA正确序列)。

由于重组菌株中还存在温敏型载体pKD46-cas9-gRNA，所以接下来，将正确的BL21(DE3)重组菌株(lpxM::sfGFP-LEVLFQGP-SsrA)在42℃下培养12-16h，进行质粒消除。筛选得到的能在LB平板上生长而同时不能在LA平板上生长的菌株，即为质粒消除成功的BL21(DE3)(lpxM::sfGFP-LEVLFQGP-SsrA)重组菌株，命名为BL21(DE3)-SPEC。

实施例4

分别在不同温度(37,30,25和18℃)下，在BL21(DE3)-SPEC重组菌株中，使用split-HRV 3C(K82)蛋白酶评估最终的SPEC系统的工作效果

将split-HRV 3C(K82)蛋白酶系列载体(SPEC-VD和SPEC-VE)，分别共转化BL21(DE3)-SPEC宿主中，在不同温度(37,30,25和18℃)下，采用实施例1中所述的方法进行诱导表达，CytoFLEX流式细胞仪检测结果。如图9所示，测试不同的强相互作用蛋白对(来源于原核生物运动发酵单胞菌的Cas1/Cas2-3和来源于真核生物酿酒酵母的Yae1/Lto1)，在不同温度(37,30,25和18℃)下，分别在4,6,8,16h左右，呈现出最高的绿色荧光蛋白表达水平，这说明split-HRV 3C(K82)蛋白酶在最终的SPEC系统中依然表现出良好的功能活性和灵敏性。

该系统是一种操作简单、能用于定量检测分析原核或真核物种来源的蛋白相互作用的高灵敏方法，同时具有宽阔的温度范围适应能力。另外，鉴于split-HRV 3C(K82)蛋白酶比split-TEV蛋白酶具有更好地功能活性和灵敏性，因此split-HRV 3C(K82)蛋白酶也可以替代split-TEV蛋白酶，广泛应用于其他的split-蛋白酶相关技术中。并且ClpXP-SsrA降解途径广泛存在于其他细菌物种(诸如枯草芽孢杆菌等等)中，因此SPEC系统方法也可以轻易移植于其他细菌物种中进行研究。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。