一种协同抑制幽门螺旋杆菌的鼠李糖乳杆菌LR863和鼠李糖乳杆菌LR519及其应用

摘要

本发明属于微生物技术领域，提出了一种协同抑制幽门螺旋杆菌的鼠李糖乳杆菌LR863和鼠李糖乳杆菌LR519及其应用，包括鼠李糖乳杆菌LR863和鼠李糖乳杆菌LR519，该混合益生菌用于制备抑制口腔和胃部的幽门螺杆菌、改善肠道的食品，食品包括组分A和组分B，组分A为质量比为1～2：1的鼠李糖乳杆菌LR863和鼠李糖乳杆菌LR519组成的混合益生菌，组分B包括以下重量份的组分：猴头菇粉15份，低聚半乳糖3份，茯苓粉15份，螺旋藻10份，沙棘粉20份，还包括组分C，组分C为双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌中的一种或多种。通过上述技术方案，解决了现有技术中抑制幽门螺杆菌的组合物对幽门螺杆菌的抑制效果较单一的问题。

说明书

技术领域

本发明属于微生物技术领域，涉及一种协同抑制幽门螺旋杆菌的鼠李糖乳杆菌LR863和鼠李糖乳杆菌LR519及其应用。

背景技术

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)是一种螺旋形、单极、多鞭毛的革兰氏阴性、微需氧菌，主要定植于胃部及十二指肠的各区域内，在部分人的口腔及粪便中同样能检测到幽门螺杆菌的存在。Hp与多种消化系统疾病密切相关，Hp感染是慢性胃炎、消化性溃疡及胃癌等多种消化道疾病的重要病因，世界卫生组织已经把Hp列为Ⅰ类致癌原。

人本身是一个复杂的生命体，体表及体内的粘膜上存在数量庞大结构复杂的微生物群落。随着对Hp研究的不断加深，幽门螺杆菌的存在部位口腔、胃部、肠道它们不再是一个单独存在的器官而是彼此密切相关众多菌群的共生体。口腔中包含众多器官，作为与外界直接接触的消化道，以及其特殊的结构，其内存在上百万种各类微生物，口腔与胃HP感染之间具有明显的相关性，口腔菌斑是胃粘膜HP再感染的主要来源之一。虽然在胃液的作用下，绝大部分微生物难以在胃部生存。但最近发现，胃内细菌种类繁多，其中以变形菌门、拟杆菌门、芽单胞菌门、门放线菌门、梭菌门为主。肠道作为人体微生物最为集中部位，生活着大量微生物，总重量约为1.5公斤，包含大约百万亿个细菌。口腔、胃肠道是微生物群落最主要的栖息地，胃肠道菌群不但维持着人体健康，同时也参与机体众多病理生理过程，与许多疾病的发病机制密切相关。益生菌可以修复胃粘膜的粘膜通透性，形成粘膜屏障，抑制H.pylori等病原菌的粘附。

幽门螺杆菌的治疗根据其有效成分大致分为抗生素、中药成分、各类生物活性物质、各类抑菌物质、微生物制或各类混合制剂。目前幽门螺杆菌的常规治疗以四联疗法(铋剂和质子泵抑制剂联合两种抗生素)为主，虽然能够短时间有效杀菌但根除率逐渐降低，Hp抗药性持续增加，加之胃肠道正常菌群受到破坏，外来致病菌定植，使患者饱受腹痛、腹泻、腹胀、便秘、恶心等消化道副反应；对于益生菌菌株，现有文献中已经公开了枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、粪肠球菌、长双歧杆菌、卷曲乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、唾液乳杆菌等益生菌菌株具有抑制幽门螺杆菌的效果，但是单一益生菌菌株对幽门螺杆菌的抑制效果相对较差。

此外，CN02136931公布了一种用于抑杀幽门螺杆菌的生物制剂及其制备方法和应用，具有杀菌功能的蛋白质和多肽；CN202010104360-公布了一种抗口腔幽门螺杆菌的益生菌牙膏及其制备方法，包含三类益生菌；CN201110179109公布了一种用于治疗胃溃疡的乳酸菌菌株的食品组合物以及医药组合物；CN201811468833公布了一种调节肠道菌群的组合物及其制备方法。以上专利虽然提供了有效的抑制幽门螺杆菌的单菌株、混合菌株、中药成分及各类活性物质及组合物，但是这些组合物对幽门螺杆菌的抑制效果较单一，只能单独抑制口腔或者单独抑制胃部的油门螺杆菌，因此，开发一种能有效抑制口腔和胃部的幽门螺杆菌、改善胃肠道不适的混合益生菌，很有必要。

发明内容

本发明提出一种协同抑制幽门螺旋杆菌的鼠李糖乳杆菌LR863和鼠李糖乳杆菌LR519及其应用，解决了现有技术中抑制幽门螺杆菌的组合物对幽门螺杆菌的抑制效果较单一的问题。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种协同抑制幽门螺杆菌的鼠李糖乳杆菌LR863和鼠李糖乳杆菌LR519的混合菌，包括鼠李糖乳杆菌LR863和鼠李糖乳杆菌LR519，所述鼠李糖乳杆菌LR863的保藏编号为CGMCC No.14410，所述鼠李糖乳杆菌LR519，保藏编号为CGMCCNo.15969。

作为进一步的技术方案，所述鼠李糖乳杆菌LR863和鼠李糖乳杆菌LR519的质量比为1～2：1。

作为进一步的技术方案，所述鼠李糖乳杆菌LR863和鼠李糖乳杆菌LR519的质量比为1：1。

本发明还提出了一种协同抑制幽门螺杆菌的鼠李糖乳杆菌LR863和鼠李糖乳杆菌LR519的混合菌的应用，其特征在于，用于制备抑制口腔和胃部的幽门螺杆菌、改善肠道的食品。

作为进一步的技术方案，所述食品包括组分A和组分B，

所述组分A为质量比为1～2：1的鼠李糖乳杆菌LR863和鼠李糖乳杆菌LR519组成的混合益生菌，

所述组分B包括以下重量份的组分：猴头菇粉15份，低聚半乳糖3份，茯苓粉15份，螺旋藻10份，沙棘粉20份。

作为进一步的技术方案，所述组分A和所述组分B的质量比为1～3：11。

作为进一步的技术方案，所述食品还包括组分C，所述组分C为双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌中的一种或多种。

作为进一步的技术方案，所述组分A和所述组分B、所述组分C的质量比为1～3：11：(1～2)。

本发明的工作原理及有益效果为：

1、本发明中，组分A为鼠李糖乳杆菌LR863与鼠李糖乳杆菌LR519的混合益生菌，鼠李糖乳杆菌LR863与鼠李糖乳杆菌LR519协同作用，能有效抑制口腔和胃部的幽门螺杆菌，将鼠李糖乳杆菌LR863与鼠李糖乳杆菌LR519按特定质量比混合得到的混合益生菌相较于鼠李糖乳杆菌LR863与鼠李糖乳杆菌LR519的单一菌株，对幽门螺杆菌的抑制效果显著提高，当鼠李糖乳杆菌LR863、鼠李糖乳杆菌LR519在质量比分别为1：1时的抑菌效果最好。

2、本发明中，组分B包括猴头菇粉、低聚半乳糖、茯苓粉、螺旋藻、沙棘粉，猴头菇粉与茯苓粉、螺旋藻、沙棘粉相互配伍，可抑制胃酸，提高胃粘膜活力，修复溃疡。

3、本发明中，组分C为为双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌中的一种或多种，组分C与低聚半乳糖相互协同，在补充益生菌的同时为胃肠道菌群提供营养，增加肠道内乳杆菌的含量，维持胃肠道菌群平衡，提升胃肠道免疫力。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下述实施例及对比例中，各益生菌均保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号如下：

鼠李糖乳杆菌LR863，分类命名为鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)，该菌株在中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏日期2017年07月12日，保藏编号为CGMCC No.14410，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；

鼠李糖乳杆菌LR519，保藏编号为CGMCCNo.15969；

副干酪乳杆菌1069，分类命名为副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)，该菌株在中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏日期2019年10月14日，保藏编号为CGMCC No.18676，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；

瑞士乳杆菌L551，保藏编号为CGMCC NO.15604；

植物乳杆菌LP45，保藏编号为CGMCCNo.8072；

嗜酸乳杆菌La28，保藏编号为GMCCNo.11506；

副干酪乳杆菌L578，保藏编号为GMCCNo.1560。

一、实施例

实施例1

一种抑制幽门螺杆菌的混合益生菌，包括质量比为1：1的鼠李糖乳杆菌LR863和鼠李糖乳杆菌LR519。

实施例2

一种抑制幽门螺杆菌的混合益生菌，包括质量比为3：2的鼠李糖乳杆菌LR863和鼠李糖乳杆菌LR519。

实施例3

一种抑制幽门螺杆菌的混合益生菌，包括质量比为2：1的鼠李糖乳杆菌LR863和鼠李糖乳杆菌LR519。

实施例4

一种抑制幽门螺杆菌的混合益生菌，包括质量比为1：2的鼠李糖乳杆菌LR863和鼠李糖乳杆菌LR519。

实施例5

一种抑制幽门螺杆菌的混合益生菌，包括质量比为4：1的鼠李糖乳杆菌LR863和鼠李糖乳杆菌LR519。

实施例6

一种抑制幽门螺杆菌的混合益生菌，包括质量比为1：4的鼠李糖乳杆菌LR863和鼠李糖乳杆菌LR519。

实施例7

一种抑制幽门螺杆菌的混合益生菌，包括质量比为2：3的鼠李糖乳杆菌LR863和鼠李糖乳杆菌LR519。

对比例1

一种抑制幽门螺杆菌的益生菌，包括鼠李糖乳杆菌LR863。

对比例2

一种抑制幽门螺杆菌的益生菌，包括鼠李糖乳杆菌LR519。

上述实施例及对比例的益生菌培养：按1％接种量接种与盛有液体MRS培养基的试管中，37℃条件下静置培养18h。

对照组1

对比例1的混合益生菌上清液。

对照组2

对比例2的混合益生菌上清液。

对照组3

实施例1的混合益生菌上清液。

对照组中益生菌上清液的获得：分别将实施例1、对比例1、对比例2的培养菌液于4℃10000×g离心3min，获得上清液后用0.22μm滤器过滤除菌，得到；

以实施例1～7及对比例1～2、对照组1～3的益生菌为目标菌，进行如下目标菌体外抑菌实验：

幽门螺杆菌活化两代后，用1×10

表1实施例1～7及对比例1～2的益生菌体外抑菌实验结果

从表1中数据可以看出，与对比例1～2相比，实施例1～6的混合益生菌的抑菌效果均显著提高，其中实施例1～3的混合益生菌抑菌效果相对较好，实施例1的混合益生菌的抑菌效果最好，说明与单一菌株鼠李糖乳杆菌LR863、鼠李糖乳杆菌LR519相比，当鼠李糖乳杆菌LR863、鼠李糖乳杆菌LR519特定质量比下(1：1、3：2、2：1、1：2、1：4和4：1)混合时得到的混合益生菌的抑菌效果均显著提高，其中，当鼠李糖乳杆菌LR863、鼠李糖乳杆菌LR519在质量比分别为1：1、3：2、和2：1时的抑菌效果相对较好，其中，当鼠李糖乳杆菌LR863、鼠李糖乳杆菌LR519在质量比分别为1：1时的抑菌效果最好。从对照组1～3的数据可以看出，将鼠李糖乳杆菌LR863上清液与鼠李糖乳杆菌LR519上清液混合后的抑菌效果并没有比单一鼠李糖乳杆菌LR863上清液和鼠李糖乳杆菌LR519上清液的抑菌效果好很多，说明将鼠李糖乳杆菌LR863上清液与鼠李糖乳杆菌LR519上清液混合后对幽门螺杆菌的抑制效果并没有协同增效，而将鼠李糖乳杆菌LR863、鼠李糖乳杆菌LR519混合后对幽门螺杆菌具有协同增效的作用。因此，在益生菌总量一定的情况下，特定质量比的鼠李糖乳杆菌LR863、鼠李糖乳杆菌LR519具有下同增效的效果，显著提升了抑制幽门螺杆菌效果。

对比例3

一种抑制幽门螺杆菌的益生菌，包括副干酪乳杆菌1069。

对比例4

一种抑制幽门螺杆菌的益生菌，包括瑞士乳杆菌L551。

对比例5

一种抑制幽门螺杆菌的益生菌，包括植物乳杆菌LP45。

对比例6

一种抑制幽门螺杆菌的益生菌，包括嗜酸乳杆菌La28。

对比例7

一种抑制幽门螺杆菌的益生菌，包括副干酪乳杆菌L578。

对比例8

一种抑制幽门螺杆菌的混合益生菌，包括质量比为1：1的副干酪乳杆菌1069和瑞士乳杆菌L551。

对比例9

一种抑制幽门螺杆菌的混合益生菌，包括质量比为1：1的鼠李糖乳杆菌LR863和副干酪乳杆菌1069。

对比例10

一种抑制幽门螺杆菌的混合益生菌，包括质量比为1：1的植物乳杆菌LP45和瑞士乳杆菌L551。

对比例11

一种抑制幽门螺杆菌的混合益生菌，包括质量比为1：1的嗜酸乳杆菌La28和副干酪乳杆菌1069。

对比例12

一种抑制幽门螺杆菌的混合益生菌，包括质量比为1：1的嗜酸乳杆菌La28和瑞士乳杆菌L551。

对比例13

一种抑制幽门螺杆菌的混合益生菌，包括质量比为1：1的嗜酸乳杆菌La28和副干酪乳杆菌L578。

对比例14

一种抑制幽门螺杆菌的混合益生菌，包括质量比为1：1的副干酪乳杆菌1069和瑞士乳杆菌L551。

对比例15

一种抑制幽门螺杆菌的混合益生菌，包括质量比为1：1的鼠李糖乳杆菌LR863和嗜酸乳杆菌La28。

对比例16

一种抑制幽门螺杆菌的混合益生菌，包括质量比为1：1的鼠李糖乳杆菌LR863和瑞士乳杆菌L551。

对比例17

一种抑制幽门螺杆菌的混合益生菌，包括质量比为1：1的鼠李糖乳杆菌LR863和副干酪乳杆菌L578。

对比例18

一种抑制幽门螺杆菌的混合益生菌，包括质量比为1：1的鼠李糖乳杆菌LR519和副干酪乳杆菌1069。

以实施例1及对比例1～18的益生菌为目标菌，进行如下目标菌体外抑菌实验：

幽门螺杆菌活化两代后，用1×10

表2实施例1及对比例1～18的益生菌体外抑菌实验结果

从上表中数据可以看出，对比例1～7均为单一益生菌，实施例1、对比例8～18均为混合益生菌，对比例8～14的混合益生菌的抑菌效果与各自混合益生菌中的单一益生菌相比均下降，而对比例15～18的混合益生菌的抑菌效果与各自混合益生菌的单一益生菌相比均提高，但是对比例15～18的混合益生菌的抑菌效果均比实施例1的混合益生菌的抑菌效果差，说明，在总量不变的情况下，两种分别具有抑菌效果的益生菌按照质量比1：1混合得到的混合益生菌的抑菌效果并不都是比原单一益生菌的抑菌效果好，而对于比原单一益生菌的抑菌效果好的混合益生菌中，实施例1的由质量比1：1的鼠李糖乳杆菌LR863、鼠李糖乳杆菌LR519混合得到的混合益生菌的效果最好，因此，本发明中将质量比为1：1鼠李糖乳杆菌LR863、鼠李糖乳杆菌LR519混合，产生了意料不到的效果。

以对比例1～7的益生菌为目标菌，进行如下目标菌疏水性测定：

将活化好的目标菌悬浊液4000r/min离心10min；收集菌泥弃上清，加入1ml的PBS吹吸混匀，4000r/min离心10min；弃上清加入PBS，在600nm吸光度，调OD值为0.40。记为A0；按1：1(v/v)加入二甲苯溶液，震荡5min，再静置1h后取水相；以PBS缓冲液为对照，测其在600nm处吸光度，记值为A；细菌细胞表面疏水率按如下公式进行计算：疏水率＝[(A0－A)/A0]×100％；测试结果见下表：

表3对比例1～7的益生菌疏水率

从上表中数据可以看出，就单一的益生菌来说，鼠李糖乳杆菌LR863的疏水率最高，说明鼠李糖乳杆菌LR863的疏水性强，与胃肠道上皮粘膜细胞的作用强，抑制幽门螺杆菌的效果好。

二、应用实施例

应用实施例1

利用实施例1的抑制幽门螺杆菌的混合益生菌制备抑制口腔和胃部的幽门螺杆菌、改善肠道的食品：

以实施例1的混合益生菌为组分A，与组分B按照质量比1：11混合，得到抑制口腔和胃部的幽门螺杆菌、改善肠道的食品，其中，组分B包括以下重量份的组分：猴头菇粉15份，低聚半乳糖3份，茯苓粉15份，螺旋藻10份，沙棘粉20份。

应用实施例2

利用实施例2的抑制幽门螺杆菌的混合益生菌制备抑制口腔和胃部的幽门螺杆菌、改善肠道的食品：

以实施例2的混合益生菌为组分A，与组分B按照质量比3：11混合，得到抑制口腔和胃部的幽门螺杆菌、改善肠道的食品，其中，组分B包括以下重量份的组分：猴头菇粉15份，低聚半乳糖3份，茯苓粉15份，螺旋藻10份，沙棘粉20份。

应用实施例3

利用实施例3的抑制幽门螺杆菌的混合益生菌制备抑制口腔和胃部的幽门螺杆菌、改善肠道的食品：

以实施例3的混合益生菌为组分A，与组分B和组分C按照质量比1：11：1混合，得到抑制口腔和胃部的幽门螺杆菌、改善肠道的食品，其中，组分B包括以下重量份的组分：猴头菇粉15份，低聚半乳糖3份，茯苓粉15份，螺旋藻10份，沙棘粉20份，组分C为双歧杆菌。

应用实施例4

利用实施例1的抑制幽门螺杆菌的混合益生菌制备抑制口腔和胃部的幽门螺杆菌、改善肠道的食品：

以实施例1的混合益生菌为组分A，与组分B和组分C按照质量比1：11：2混合，混合，得到抑制口腔和胃部的幽门螺杆菌、改善肠道的食品，其中，猴头菇粉15份，低聚半乳糖3份，茯苓粉15份，螺旋藻10份，沙棘粉20份，组分C为双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和植物乳杆菌。

以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。