一种用于鉴别暗纹东方鲀、红鳍东方鲀及杂交东方鲀的特异性引物及其方法

摘要

本发明公开了一种用于鉴别暗纹东方鲀、红鳍东方鲀及杂交东方鲀的特异性引物及其方法，所述特异性引物包括正向引物和反向引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1‑2所示。其鉴别方法首先采集待鉴别的河鲀样品，提取基因组DNA；然后以三种河鲀鱼基因组DNA为模板，用引物对其进行PCR扩增；最后对扩增产物进行电泳并根据条带差异进行鉴定。利用本发明的特异性引物鉴别暗纹东方鲀、红鳍东方鲀及杂交东方鲀的方法无需微卫星上机测序等复杂步骤，仅根据条带数量和位置即可快速准确的对三种鱼进行区分，具有稳定性好、实用性强、操作简单、准确率高等优点。

说明书

技术领域

本发明属于水产养殖技术领域，具体涉及一种鉴别暗纹东方鲀、红鳍东方鲀及杂交东方鲀的特异性引物及方法。

背景技术

暗纹东方鲀（

杂交育种通过将亲本基因型进行重新组合，使其后代可同时具有亲本的优良性状，甚至可能出现亲本不具备的一些形状特征，并具有一定的杂种优势。已报道的暗纹东方鲀雌鱼和红鳍东方鲀雄鱼杂交产生的杂交东方鲀，既具有暗纹东方鲀的丰富风味，又具有红鳍东方鲀生长快速的特性。尽管三种东方鲀在成鱼时期外观体型差异较明显，凭肉眼即可区分，但三种鱼在稚、幼鱼时期，外观体型十分相似，无法用肉眼区分。此外，对于部分河鲀组织或者加工的肉制品等难以从外观对其区分。随着近些年来河鲀养殖面临着种质混杂、品质退化严重、无序杂交等突出问题，因此，亟需一种物种鉴定方法对暗纹东方鲀、红鳍东方鲀及杂交东方鲀进行区分。

物种鉴定一直是分类学乃至几乎所有生物领域上至关重要的研究步骤。因此，准确的对物种鉴定和分类就显得尤其重要。作为第二代分子标记，微卫星具有多态性、杂合率高、共显性遗传等特点。近年来，河鲀物种中微卫星标记的开发主要应用于分析河鲀不同地理群体间遗传多样性、近缘物种间种质进化及物种鉴定等方面。但目前为止，关于东方鲀属属间物种鉴别的报道并不多，关于暗纹东方鲀、红鳍东方鲀及杂交东方鲀鉴定的研究至今尚未见报道。传统利用微卫星标记技术鉴定物种的方法是在引物对的前引添加18bp特异荧光片段，并在PCR扩增体系中添加荧光试剂，对扩增后的PCR产物使用DNA测序仪ABI 3730xl进行毛细管荧光电泳检测，根据等位基因峰值读取微卫星位点基因型，检测不同物种间基因型的差异或不同引物的多态性。操作繁琐、费时、成本较高。

发明内容

发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种有效区分暗纹东方鲀、红鳍东方鲀及杂交东方鲀种间鉴定的特异性引物；该引物组可快速、精准地对三种东方鲀进行鉴定。

本发明还提供了所述的用于鉴别暗纹东方鲀、红鳍东方鲀及杂交东方鲀的方法。

技术方案：为了实现上述目的，本发明所述一种用于鉴别暗纹东方鲀、红鳍东方鲀及杂交东方鲀[暗纹东方鲀（♀）×红鳍东方鲀（♂），杂交东方鲀是由雌性暗纹东方鲀和雄性红鳍东方鲀杂交产生的杂交种]的特异性引物，所述特异性引物包括正向引物和反向引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-2所示：

正向引物SEQ ID NO.1：5′-AAAGGGGAGTTTTTCCTTGCCACT-3′；

反向引物SEQ ID NO.2：5′-CCCACATTCTCTCCATCTCCTCCT-3′。

本发明所述用于鉴别暗纹东方鲀、红鳍东方鲀及杂交东方鲀方法的试剂盒，其包括所述的特异性引物。

本发明利用所述的特异性引物鉴别暗纹东方鲀、红鳍东方鲀及杂交东方鲀的方法，包括下列步骤：

（1）提取待鉴定的东方鲀基因组DNA；

（2）用所述的特异性引物对3种东方鲀DNA进行PCR扩增；

（3）琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测。

其中，步骤（2）所述PCR扩增反应体系为灭菌水7.4μL，2×Taq Plus Mix 10μL，10uM正反特异性引物各0.8μL DNA1μL。

其中，步骤（2）所述PCR扩增反应程序为95℃预变性5min；40个循环：94℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸30sec；最后72℃延伸7min，4℃保存。

其中，步骤（3）PCR产物检测其中暗纹东方鲀有3条条带，位置分别在150bp、800bp和1500bp左右；红鳍东方鲀有3条条带，位置分别在150bp、1000bp和1800bp左右；杂交东方鲀有5条条带，位置分别处于150bp、800bp、1000bp、1500bp和1800bp左右。

本发明通过对微卫星标记技术进行优化，不需添加荧光引物和荧光试剂，仅通过优化PCR扩增条件和电泳条件，即可通过电泳图谱对暗纹东方鲀、红鳍东方鲀及其杂交种进行鉴定，简单高效。

本发明利用微卫星筛选软件MISA对暗纹东方鲀全基因组微卫星进行筛选并分析。随后根据全基因组中筛选出的大量微卫星位点结合脚本、引物软件进行批量开发引物，挑选出相关引物进行合成。提取暗纹东方鲀、红鳍东方鲀和杂交东方鲀尾鳍DNA，以DNA为模板进行扩增，琼脂糖凝胶电泳观察条带位置对3种河鲀加以区分。在实验过程中，发明人发现该微卫星引物特异性较低，不同的扩增条件（退火温度、延伸时间和循环次数）和琼脂糖浓度均对电泳结果有影响。本发明通过改变扩增条件和琼脂糖浓度，最终确定的扩增条件为最适条件。

本发明通过PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳，根据条带数目和位置对不同物种进行鉴定区分。简单、高效实现3种河鲀的物种鉴定，便捷、成本低。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下优点：

（1）本发明提供了一种用于鉴别暗纹东方鲀、红鳍东方鲀及杂交东方鲀的引物及方法，不受三种鱼个体年龄、性别、群体等限制，引物稳定性强、精准度高。

（2）通过本发明设计的引物，本方法仅需PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳检测即可得到稳定、清晰、差异明显的扩增条带，成本低，操作简单，实用性强。

附图说明

图1为暗纹东方鲀、红鳍东方鲀和杂交东方鲀3个群体中的扩增电泳结果。M-Marker；1-8为暗纹东方鲀；9-16为红鳍东方鲀；17-24为杂交东方鲀；

图2为在不同地区暗纹东方鲀、野生红鳍东方鲀和养殖杂交东方鲀三个群体中的部分扩增电泳结果。M-Marker；1-8为暗纹东方鲀；9-16为红鳍东方鲀；17-24为杂交东方鲀；

图3为暗纹东方鲀、红鳍东方鲀和杂交东方鲀3个群体利用特异性引物，通过改变PCR反应条件扩增的电泳结果。M-Marker；1-8为暗纹东方鲀；9-16为红鳍东方鲀；17-24为杂交东方鲀；

图4为暗纹东方鲀、红鳍东方鲀和杂交东方鲀3个群体利用微卫星荧光引物扩增的电泳结果。M-Marker；1-8为暗纹东方鲀；9-16为红鳍东方鲀；17-24为杂交东方鲀；

图5为暗纹东方鲀、红鳍东方鲀和杂交东方鲀3个群体利用微卫星荧光引物、微卫星扩增体系扩增的电泳结果。M-Marker；1-8为暗纹东方鲀；9-16为红鳍东方鲀；17-24为杂交东方鲀。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

本发明基于SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的一对微卫星引物对暗纹东方鲀、红鳍东方鲀及杂交东方鲀基因组DNA提取、PCR扩增以及琼脂糖凝胶电泳结果分析，根据电泳差异条带结果对三种东方鲀进行鉴定。可应用于暗纹东方鲀、红鳍东方鲀及杂交东方鲀苗种的鉴定。

实施例1

（1）暗纹东方鲀、红鳍东方鲀及杂交东方鲀三个群体样本的获得

取材包括种类确定的暗纹东方鲀、红鳍东方鲀及杂交东方鲀各8尾共24个样品，其中暗纹东方鲀苗种来自江苏中洋集团股份有限公司（海安基地），并在南京市水产科学研究所禄口实验基地养殖5月龄并取材；5月龄的红鳍东方鲀和杂交东方鲀均从从江苏中洋集团股份有限公司（海安基地）取材。

（2）暗纹东方鲀、红鳍东方鲀及杂交东方鲀基因组DNA的提取

每尾鱼取尾鳍10～30mg，利用DNA提取试剂盒（购自北京百泰克生物公司）对24尾河鲀进行基因组DNA的提取。

（3）微卫星位点的筛选及引物的合成

首先利用微卫星筛选软件MISA对暗纹东方鲀全基因组微卫星进行筛选，结合脚本，利用Primer 5.0软件批量开发暗纹东方鲀全基因组微卫星引物，挑选100对引物并合成（引物由上海捷瑞生物公司合成）。

（4）暗纹东方鲀、红鳍东方鲀及杂交东方鲀实验结果分析

利用（2）中提取的河鲀样品DNA，采用PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳检验（3）中合成的引物在三者中的扩增情况。具体过程如下：

1)PCR扩增体系

PCR扩增反应体系(20μL)如下：灭菌水(7.4μL)，2×Taq Plus Mix(10μL)（购自上海皆益生物科技有限公司），10uM正反引物(各0.8μL)，河鲀尾鳍DNA(1μL)。

2)PCR扩增反应

在PCR扩增仪上于95℃预变性5min；40个循环：94℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸30sec；最后72℃延伸7min，4℃保存。

3)琼脂糖凝胶电泳检测

取DNA Marker 2000 4μL、PCR扩增反应产物5μL进行琼脂糖凝胶电泳检测，EB染色并用紫外凝胶成像系统拍照。

4)根据电泳结果确定特异性引物

共合成100对微卫星引物，经过PCR扩增、琼脂糖电泳实验挑选出能在暗纹东方鲀、红鳍东方鲀及杂交东方鲀中均可以成功扩增且产物经3)检测可在三者中得出明显差别条带的一对引物，所述的引物序列为：

SEQ ID NO.1：F：5′-AAAGGGGAGTTTTTCCTTGCCACT-3′；

SEQ ID NO.2：R：5′-CCCACATTCTCTCCATCTCCTCCT-3′。

此对引物所得产物的电泳图如图1所示，根据电泳条带与标准Marker比较：出现3个条带，位置分别处于150bp、800bp和1500bp左右的为暗纹东方鲀；出现3个条带，分别处于150bp、1000bp和1800bp左右的为红鳍东方鲀；出现5个条带，位置分别处于150bp、800bp、1000bp、1500bp和1800bp左右的为杂交东方鲀。由电泳图谱即可将暗纹东方鲀、红鳍东方鲀及杂交东方鲀区别开来。

实施例2

(1)暗纹东方鲀、红鳍东方鲀及杂交东方鲀不同群体的获得：

取材包括种类确定的暗纹东方鲀、红鳍东方鲀及杂交东方鲀各20尾共60个样品，其中20尾5月龄暗纹东方鲀分别来自江苏中洋集团股份有限公司(海安，8尾)、镇江江之源渔业科技有限公司（扬中，6尾）和江阴市申港三鲜养殖有限公司（江阴，6尾）；20尾3龄野生红鳍东方鲀取自山东烟台石岛；20尾5月龄养殖杂交东方鲀取自江苏中洋集团股份有限公司(海安基地)。

(2)暗纹东方鲀、红鳍东方鲀及杂交东方鲀基因组DNA的提取

具体基因组DNA提取步骤参考实施例1的步骤（1）。

(3)暗纹东方鲀、红鳍东方鲀及杂交东方鲀实验结果分析

具体实验步骤参考实施例1（4）。利用实施例1的引物在三种东方鲀共60个个体中进行PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳检验，结果同实施例1电泳结果一致。20尾来自不同地区不同家系的暗纹东方鲀同实施例1中8尾同一家系暗纹东方鲀电泳条带一致，均出现3条带，条带位置分别处于150bp、800bp和1500bp左右。20尾野生红鳍东方鲀同实施例1中8尾中洋集团股份有限公司养殖的红鳍东方鲀电泳条带一致，均出现3条带，条带位置分别处于150bp、1000bp和1800bp左右。20尾中洋集团股份有限公司养殖的杂交东方鲀同实施例1中8尾江苏杂交东方鲀中洋集团股份有限公司不同群体的养殖杂交东方鲀电泳条带一致，均出现5条带，条带位置分别处于150bp、800bp、1000bp、1500bp和1800bp左右。该引物在暗纹东方鲀、红鳍东方鲀及杂交东方鲀所有个体中鉴别准确率为100%。

对比例1

（1）暗纹东方鲀、红鳍东方鲀及杂交东方鲀三个群体样本的获得

具体三个群体样本的获得参考实施例1的步骤（1）。

（2）暗纹东方鲀、红鳍东方鲀及杂交东方鲀基因组DNA的提取

具体基因组DNA提取步骤参考实施例1的步骤（2）。

（3）微卫星引物的筛选及引物的合成

本对比例中使用引物参考实施例1中的特异性引物对。

（4）暗纹东方鲀、红鳍东方鲀及杂交东方鲀实验结果分析

利用（2）中提取的河鲀样品DNA，采用PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳检验（3）中引物在三者中的扩增情况。

具体过程如下：

1)PCR扩增体系

PCR扩增体系参考实施例1的步骤（4）。

2）PCR扩增反应

在PCR扩增仪上95℃预变性5min；35个循环：94℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸2min；最后72℃延伸7min，4℃保存。

3)琼脂糖凝胶电泳检测

琼脂糖凝胶电泳检测参考实施例1的步骤（4）。

4)根据电泳结果确定特异性引物

此扩增条件所得产物的电泳图如图3所示，暗纹东方鲀、红鳍东方鲀及杂交东方鲀部分扩增条带较暗、较乱。且与图1、图2相比，图3中3种河鲀个别条带未成功扩增。因此与实施例1和2相比，改变PCR扩增反应无法准确的将暗纹东方鲀、红鳍东方鲀及杂交东方鲀区别开来。

对比例2

（1）暗纹东方鲀、红鳍东方鲀及杂交东方鲀三个群体样本的获得

具体三个群体样本的获得参考实施例1的步骤（1）。

（2）暗纹东方鲀、红鳍东方鲀及杂交东方鲀基因组DNA的提取

具体基因组DNA提取步骤参考实施例1的步骤（2）。

（3）微卫星引物的筛选及引物的合成

本对比例中使用引物参考实施例1中的特异性引物对，但在特异性引物对正向引物前添加18bp荧光片段，所述的荧光引物对序列为：

SEQ ID NO.3：

F：5′-TGTAAAACGACGGCCAGTAAAGGGGAGTTTTTCCTTGCCACT-3′；

SEQ ID NO.4：R：5′-CCCACATTCTCTCCATCTCCTCCT-3′。

将该引物对送至公司合成（引物由上海捷瑞生物公司合成）。

（4）暗纹东方鲀、红鳍东方鲀及杂交东方鲀实验结果分析

利用（2）中提取的河鲀样品DNA，采用PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳检验（3）中合成的荧光引物在三者中的扩增情况。具体PCR扩增体系、PCR扩增反应及琼脂糖凝胶电泳检测过程参考实施例1的步骤（4）。

1)根据电泳结果确定特异性引物

此对引物所得产物的电泳图如图4所示，暗纹东方鲀、红鳍东方鲀及杂交东方鲀部分扩增条带较暗、较乱。且与图1、图2相比，图4中3种河鲀个别条带未成功扩增。因此添加18bp荧光片段的特异性引物无法准确的将暗纹东方鲀、红鳍东方鲀及杂交东方鲀区别开来。

对比例3

（1）暗纹东方鲀、红鳍东方鲀及杂交东方鲀三个群体样本的获得

具体三个群体样本的获得参考实施例1的步骤（1）。

（2）暗纹东方鲀、红鳍东方鲀及杂交东方鲀基因组DNA的提取

具体基因组DNA提取步骤参考实施例1的步骤（2）。

（3）微卫星引物的筛选及引物的合成

本对比例中使用引物参考实施例1中的特异性引物对，但在特异性引物对正向引物前添加18bp荧光片段，所述的荧光引物对序列为：

SEQ ID NO.3：

F：5′-TGTAAAACGACGGCCAGTAAAGGGGAGTTTTTCCTTGCCACT-3′；

SEQ ID NO.4：R：5′-CCCACATTCTCTCCATCTCCTCCT-3′。

将该引物对送至公司合成（引物由上海捷瑞生物公司合成）。

（4）暗纹东方鲀、红鳍东方鲀及杂交东方鲀实验结果分析

利用（2）中提取的河鲀样品DNA，采用PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳检验（3）中合成的荧光特异引物在三者中的扩增情况。

具体过程如下：

1)微卫星荧光引物PCR扩增体系

微卫星荧光引物PCR扩增体系(10μL)如下：灭菌水(3.64μL)，2×Taq Plus Mix(5μL)（购自上海皆益生物科技有限公司），10uM荧光正向引物(0.04μL)，反向引物（0.16μL），HEX荧光试剂（0.16μL），河鲀尾鳍DNA(1μL)。

2)PCR扩增反应

PCR扩增反应参考实施例1的步骤（4）。

3)琼脂糖凝胶电泳检测

琼脂糖凝胶电泳检测参考实施例1的步骤（4）。

4)根据电泳结果确定特异性引物

通过改变微卫星引物和PCR扩增体系所得产物的电泳图如图5所示，暗纹东方鲀、红鳍东方鲀及杂交东方鲀部分扩增条带较暗、较乱。且与图1、图2相比，图5中3种河鲀个别条带未成功扩增，且部分个体条带存在拖尾现象。因此该方法无法准确的将暗纹东方鲀、红鳍东方鲀及杂交东方鲀区别开来。

上述对比例1、2和3分别利用改变扩增反应条件、添加18bp特异荧光片段的引物和普通PCR扩增体系以及利用添加18bp特异荧光片段的引物和微卫星荧光试剂扩增体系对3种河鲀进行扩增，条带较暗、较乱，无法对3种河鲀进行鉴定，说明必须采用本发明的特异性引物及扩增反应条件才能有效的对3种河鲀进行鉴定。

综上可知，本发明的一种用于鉴别暗纹东方鲀、红鳍东方鲀及杂交东方鲀的微卫星引物，在三个不同群体中具有普遍适用性，不受年龄、性别及地理位置的限制。且本发明的一种用于鉴别暗纹东方鲀、红鳍东方鲀及杂交东方鲀的微卫星分子标记方法或者鉴定方法，摆脱了传统方法操作繁琐、费时费力的缺点，具有操作简单、实用性强、省时省力、成本低、稳定性好、准确率高的优点。

序列表

<110> 南京师范大学

<120> 一种用于鉴别暗纹东方鲀、红鳍东方鲀及杂交东方鲀的特异性引物及其方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aaaggggagt ttttccttgc cact 24

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cccacattct ctccatctcc tcct 24

<210> 3

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgtaaaacga cggccagtaa aggggagttt ttccttgcca ct 42

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cccacattct ctccatctcc tcct 24