一种用于猕猴桃早期落叶病的药剂制备方法

摘要

一种用于猕猴桃早期落叶病的药剂的制备方法是以玉米秸秆、甘蔗皮、黄柏树枝、皂角树枝、槐树枝、纯化水、复合菌剂为原料，分别经提取、浓缩干燥、碳化、发酵、混合干燥制得。本发明对环境友好，解决了化学药剂对环境污染问题，抑菌性能试验表明本发明药剂对引起猕猴桃褐斑病的叶点霉菌具有极强的灭杀作用，本发明抑菌4天，即可有效灭杀叶点霉菌，发酵过程微生物之间可合理共生，不会出现微生物拮抗问题，而提取之后的浸膏主含黄柏碱、皂角皂苷、芦丁等抑菌成分，可增强微生物发酵液的抑菌效果，起到协同增效的作用，储存过程长，放置12月，产品性状不会变色，且抑菌效果不会下降，值得市场推广应用。

说明书

技术领域

本发明主要涉及猕猴桃病害防治技术领域，具体涉及一种用于猕猴桃早期落叶病药剂的制备方法。

背景技术

猕猴桃种植的时候，经常会出现严重的落叶现象，连年落叶，对树势和产量都造成严重影响，目前，引起猕猴桃落叶现象主要有两个方面，其一是生理性落叶病，其二是病理性褐斑病。针对生理性落叶病，主要通过合理修剪、科学灌水、合理负载等手段均可解决相应问题，而针对病理性褐斑病则较为难治。

猕猴桃褐斑病属于真菌性病害，其致病病原菌为叶点霉菌，该病害主要危害叶片和枝干，有时也危害果实表面，病斑主要始发于叶缘，也有叶面，初呈水渍状污绿色小斑，后沿叶缘或向内扩展，形成不规则的褐色病斑，多雨高湿条件下，病情扩散迅速，病斑由褐变黑，引起霉烂，正常气候下，病斑四周深褐色，中央褐色至浅褐色，其上散生或密生许多黑色小点粒，即病原的分生孢子器。高温下被害叶片向叶面卷曲，易破裂，后期干枯脱落，叶面中部的病斑明显比叶处的小，病斑透过叶背，呈黄棕褐色。

目前，猕猴桃褐斑病的防治主要有效手段是采用化学防治，具体方法是在病菌初侵染期就开始进行，杀菌剂选用防治真菌性病害的农药，而化学农药防治对土壤、地表水、地下水以及农产品造成污染，并进一步进入生物链，对所有环境生物和人类健康都具有严重的，长期的和潜在的危害性，因此，寻求一个可以替代化学农药对猕猴桃褐斑病进行防治是目前猕猴桃种植急需解决的问题。

发明内容

本发明目的在于提供一种用于防治叶点霉菌引起的猕猴桃早期落叶病的药剂制备方法。

本发明是这样实现的：

一种用于猕猴桃早期落叶病的药剂的制备方法，其特征在于，它是以玉米秸秆、甘蔗皮、黄柏树枝、皂角树枝、槐树枝、纯化水、复合菌剂为原料，分别经提取、浓缩干燥、碳化、发酵、混合干燥制得；其中所述提取是将黄柏树枝、皂角树枝、槐树枝加溶剂提取；所述复合菌剂是由地衣芽孢杆菌、绿色木霉菌、乳酸乳球菌、白蚁链霉菌等组成。

上述地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)为GDMCC1.182，上述绿色木霉菌(Trichoderma viride)为GDMCC3.602，上述乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)为CGMCC1.12794，上述白蚁链霉菌(Streptomyces termitum)为GDMCC802609；前述菌种均为市售产品。

进一步，所述提取是取黄柏树枝、皂角树枝、槐树枝置于万能粉碎机中，粉碎过10～20目筛，得到混合粗粉，加入混合粗粉总质量10～15倍的纯化水，设置温度80～90℃，提取2～3小时，提取结束，用滤布过滤，收集滤液和滤饼，分别保存，备用；所述黄柏树枝、皂角树枝、槐树枝质量比为1:1～3:2～5。

进一步，所述浓缩干燥是将滤液置于真空减压浓缩罐中，设置真空度为-0.05～-0.08MPa，温度为60～70℃，减压浓缩至相对密度为1.25～1.30(60℃)的稠膏，将稠膏置于减压真空干燥箱中，设置真空度为-0.05～-0.08MPa，温度为60～70℃，真空干燥24～36小时，得到干膏，将干膏置于万能粉碎机中进行粉碎，过100目筛，得到浸膏粉，备用。

进一步，所述碳化是将玉米秸秆、甘蔗皮混合粉碎，过10～20目筛，得到玉米秸秆与甘蔗皮的混合粉末，加入提取步骤收集的滤饼，混合均匀，置于真空碳化炉中，设置真空度为-30～-50pa，设置碳化温度为300～400℃，保温2～3小时，自然冷却，收集碳化后物料，备用；所述玉米秸秆与甘蔗皮的质量比为2:3～5，所述玉米秸秆与甘蔗皮的混合粉末与滤饼的质量比为10:2～4，玉米秸秆、甘蔗皮经过粉碎混合后，再与滤饼进行混合，特定粒径的玉米秸秆和甘蔗皮的混合粉末包裹于滤饼表面，形成完整包裹，再配合上述无氧碳化工艺，该碳化实现了无氧部分碳化，包裹在外层的玉米秸秆和甘蔗皮的混合粉末由外向内碳化、其碳化量为总混合粉末质量的20％～50％，而内部的滤饼未被碳化；此外，碳化的同时也是对混合粉末进行干热灭菌，为后续发酵提供无菌基质，而混合粉末表面碳化，形成孔洞，对发酵堆起到一定支撑作用，同时该孔洞结构可为后续发酵的微生物提供更好的呼吸作用，而包裹于内部的滤饼以及未被碳化的混合粉末，可通过表面的孔洞持续为后续发酵微生物提供营养物质，保证顺利发酵，不会由于滤饼等物质的参与，导致发酵环境恶化。

为了保证发酵更加彻底，上述特定的部分碳化的发酵底物配合特定的两段发酵手段可提高发酵效率，具体来讲是将上述制得的碳化混合粉末置于发酵罐中，加入纯化水，搅拌均匀，加入乳酸乳球菌和地衣芽孢杆菌，设置发酵温度为28～32℃，发酵8～10天，第一段发酵结束，然后加入绿色木霉菌、白蚁链霉菌，保持发酵温度为28～32℃，继续发酵30～35天，发酵结束，过滤，收集发酵液，备用；所述碳化混合粉末与纯化水的质量比为1:2～5，所述碳化混合粉末、乳酸乳球菌、地衣芽孢杆菌、绿色木霉菌、白蚁链霉菌的活菌数质量比为100：0.15～0.25:0.15～0.25:0.25～0.35:0.25～0.35。

乳酸乳球菌是厌氧型细菌，而地衣芽孢杆菌生长过程需要大量氧气，具有生物夺氧功能，发酵过程中，可吸收乳酸乳球菌周围的氧气，促进乳酸乳球菌发酵，另一方面，地衣芽孢杆菌发酵过程能产生多种营养物质，包括维生素，氨基酸，有机酸，促生长因子，而乳酸乳球菌在代谢过程中可消耗地衣芽孢杆菌代谢产生的维生素，同时合成叶酸等B族维生素，为发酵提供更加全面的营养物质，而乳酸乳球菌在发酵过程中，其代谢产物使得周围pH快速降低，而特定部分碳化工艺得到的混合粉末，加入纯化水后，溶液呈弱碱性，可保证整个发酵环境的pH中和为弱酸性，为微生物发酵提供更佳的发酵环境，绿色木霉菌发酵最佳pH为6.0～6.5，白蚁链霉菌发酵最佳pH为6.0～7.5，由于有部分碳化工艺得到的混合粉末存在，不会因为乳酸乳球菌的发酵产物导致pH下降，从而抑制绿色木霉菌和白蚁链霉菌的发酵；另一方面，表面形成孔洞的部分碳化混合粉末，可为发酵堆起到支撑作用，保证菌种发酵过程中的呼吸作用，同时，具有孔洞的混合粉末，又可为微生物发酵过程输送营养物质，配合特殊的两段发酵工艺，使得本发明微生物发酵效率高大幅度提高；抑菌方面，地衣芽孢杆菌具有夺氧功能，可争夺叶点霉菌周围的氧气，从而起到抑菌作用，而绿色木霉菌代谢产生毒性蛋白作用，可导致抑制叶点霉菌的氨基酸吸收与蛋白质合成障碍，减少多聚核糖体的形成，从而减弱叶点霉菌的生长，绿色木霉菌产生的葡聚糖酶还可使真菌细胞壁释放出葡聚糖来源的诱导物，启动猕猴桃的防御反应，促进猕猴桃产生和积累与抗病性有关的酚类化合物和木质素等。同时，绿色木霉菌产生的蛋白酶能使消解植物细胞壁的病原菌降解，直接抑制病原菌萌发，使病原菌的酶钝化，阻止病原菌浸入植物细胞；而白蚁链霉菌叶点霉菌又具有较强拮抗作用，最后配合提取出的浸膏粉，使得本发明药剂对叶点霉菌具有极强灭杀作用，同时还可启动猕猴桃的防御反应，共同配合，起到治疗叶点霉菌引起的猕猴桃早期落叶病的作用。

如果混合干燥控制不好，冷冻干燥过程会出现喷瓶情况，导致所干燥的产品性状不规则，另一方面，若混合干燥控制不好，也会使得本发明产品储存过程性状变色，抑菌能力下降，为了解决这一问题，取上述制得的发酵液，加入山梨醇并搅拌溶解，再加入上述制得的浸膏粉，继续搅拌至分散均匀，置于冷冻干燥箱中，迅速将温度冷冻至-38～-35℃，保持120～150分钟，然后抽真空干燥，以5～8℃/小时升温速率升温至-15～-10℃，恒温保持90～120分钟；再以5～8℃/小时升温速率升温至0℃，0℃恒温400～450分钟；再以5～8℃/小时升温速率升温至10～15℃，恒温保持360～420分钟，以8～10℃/小时升温至25～30℃，恒温60～120分钟，干燥结束，取出产品，产品水分低于6％，即得；所述发酵液、山梨醇、浸膏粉的质量比为100:150～180:10～20。山梨醇是一种多羟基化合物，具有吸湿性能且极易溶于水，它可作为发酵液与浸膏粉的赋形剂，配合冷冻干燥的技术手段手段，可防止冷冻干燥过程中出现喷瓶现象，保证本发明产品能顺利形成冻干，便于保存，另一方面，山梨醇化学稳定性较好，较大用量的山梨醇可贯穿或覆盖于发酵液和浸膏粉四周，配合特定的冷冻干燥方式，可保证本发明产品不受光照，氧化等因素的破坏，保证产品储存过程不会变色，抑菌能力不会下降。

本发明具有如下的有益效果：

本发明一种用于猕猴桃早期落叶病的药剂的制备方法制得的药剂，对环境友好，解决了化学药剂对环境污染问题，抑菌性能试验表明本发明药剂对引起猕猴桃褐斑病的叶点霉菌具有极强的灭杀作用，本发明抑菌4天，即可有效灭杀叶点霉菌，发酵过程微生物之间可合理共生，不会出现微生物拮抗问题，而提取之后的浸膏中含黄柏碱、皂角皂苷、芦丁等抑菌成分，可增强微生物发酵液的抑菌效果，起到协同增效的作用，储存过程长，放置12月，产品性状不会变色，且抑菌效果不会下降，值得市场推广应用。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

实施例1

一种用于猕猴桃早期落叶病的药剂的制备方法：

1、提取

取黄柏树枝、皂角树枝、槐树枝置于万能粉碎机中，粉碎过20目筛，得到混合粗粉，加入混合粗粉总质量15倍的纯化水，设置温度90℃，提取2小时，提取结束，用滤布过滤，收集滤液和滤饼，分别保存，备用；所述黄柏树枝、皂角树枝、槐树枝质量比为1:3:5。

2、浓缩干燥

将步骤1中制得的滤液置于真空减压浓缩罐中，设置真空度为-0.05～-0.08MPa，温度为70℃，减压浓缩至相对密度为1.29(60℃)的稠膏，将稠膏置于减压真空干燥箱中，设置真空度为-0.05～-0.08MPa，温度为70℃，真空干燥24小时，得到干膏，将干膏置于万能粉碎机中进行粉碎，过100目筛，得到浸膏粉，备用。

3、碳化

将玉米秸秆、甘蔗皮混合粉碎，过20目筛，得到玉米秸秆与甘蔗皮的混合粉末，加入提取步骤收集的滤饼，混合均匀，置于真空碳化炉中，设置真空度为-30～-50pa，设置碳化温度为400℃，保温2小时，自然冷却，收集碳化后物料，备用；所述玉米秸秆与甘蔗皮的质量比为2:5，所述玉米秸秆与甘蔗皮的混合粉末与滤饼的质量比为10:4。

4、发酵

首先是将上述制得的碳化混合粉末置于发酵罐中，加入纯化水，搅拌均匀，加入乳酸乳球菌和地衣芽孢杆菌，设置发酵温度为32℃，发酵8天，第一段发酵结束，然后加入绿色木霉菌、白蚁链霉菌，保持发酵温度为32℃，继续发酵30天，发酵结束，过滤，收集发酵液，备用；所述碳化混合粉末与纯化水的质量比为1:5，所述碳化混合粉末、乳酸乳球菌、地衣芽孢杆菌、绿色木霉菌、白蚁链霉菌的活菌数质量比为100：0.25:0.25:0.35:0.35。

5、混合干燥

取上述制得的发酵液，加入山梨醇并搅拌溶解，再加入上述制得的浸膏粉，继续搅拌至分散均匀，分装至100ml玻璃瓶中，然后置于冷冻干燥箱中，迅速将温度冷冻至-35℃，保持120分钟，然后抽真空干燥，以8℃/小时升温速率升温至-10℃，恒温保持120分钟；再以8℃/小时升温速率升温至0℃，0℃恒温400分钟；再以8℃/小时升温速率升温至15℃，恒温保持420分钟，以10℃/小时升温至30℃，恒温120分钟，干燥结束，取出产品，经检测产品水分为4.3％，即得；所述发酵液、山梨醇、浸膏粉的质量比为100:180:20。

实施例2

一种用于猕猴桃早期落叶病的药剂的制备方法：

1、提取

取黄柏树枝、皂角树枝、槐树枝置于万能粉碎机中，粉碎过16目筛，得到混合粗粉，加入混合粗粉总质量12倍的纯化水，设置温度85℃，提取2.5小时，提取结束，用滤布过滤，收集滤液和滤饼，分别保存，备用；所述黄柏树枝、皂角树枝、槐树枝质量比为1:2:4。

2、浓缩干燥

将步骤1中制得的滤液置于真空减压浓缩罐中，设置真空度为-0.05～-0.08MPa，温度为65℃，减压浓缩至相对密度为1.28(60℃)的稠膏，将稠膏置于减压真空干燥箱中，设置真空度为-0.05～-0.08MPa，温度为65℃，真空干燥32小时，得到干膏，将干膏置于万能粉碎机中进行粉碎，过100目筛，得到浸膏粉，备用。

3、碳化

将玉米秸秆、甘蔗皮混合粉碎，过16目筛，得到玉米秸秆与甘蔗皮的混合粉末，加入提取步骤收集的滤饼，混合均匀，置于真空碳化炉中，设置真空度为-30～-50pa，设置碳化温度为350℃，保温2.5小时，自然冷却，收集碳化后物料，备用；所述玉米秸秆与甘蔗皮的质量比为2:4，所述玉米秸秆与甘蔗皮的混合粉末与滤饼的质量比为10:3。

4、发酵

首先是将上述制得的碳化混合粉末置于发酵罐中，加入纯化水，搅拌均匀，加入乳酸乳球菌和地衣芽孢杆菌，设置发酵温度为30℃，发酵9天，第一段发酵结束，然后加入绿色木霉菌、白蚁链霉菌，保持发酵温度为30℃，继续发酵32天，发酵结束，过滤，收集发酵液，备用；所述碳化混合粉末与纯化水的质量比为1:4，所述碳化混合粉末、乳酸乳球菌、地衣芽孢杆菌、绿色木霉菌、白蚁链霉菌的活菌数质量比为100：0.20:0.20:0.30:0.30。

5、混合干燥

取上述制得的发酵液，加入山梨醇并搅拌溶解，再加入上述制得的浸膏粉，继续搅拌至分散均匀，分装至100ml玻璃瓶中，然后置于冷冻干燥箱中，迅速将温度冷冻至-38℃，保持150分钟，然后抽真空干燥，以5℃/小时升温速率升温至-15℃，恒温保持120分钟；再以5℃/小时升温速率升温至0℃，0℃恒温400分钟；再以5℃/小时升温速率升温至10℃，恒温保持360分钟，以8℃/小时升温至25℃，恒温120分钟，干燥结束，取出产品，经检测产品水分为4.7％，即得；所述发酵液、山梨醇、浸膏粉的质量比为100:180:20。

实施例3

一种用于猕猴桃早期落叶病的药剂的制备方法：

1、提取

取黄柏树枝、皂角树枝、槐树枝置于万能粉碎机中，粉碎过10目筛，得到混合粗粉，加入混合粗粉总质量10倍的纯化水，设置温度80℃，提取3小时，提取结束，用滤布过滤，收集滤液和滤饼，分别保存，备用；所述黄柏树枝、皂角树枝、槐树枝质量比为1:1:2。

2、浓缩干燥

将步骤1中制得的滤液置于真空减压浓缩罐中，设置真空度为-0.05～-0.08MPa，温度为60℃，减压浓缩至相对密度为1.30(60℃)的稠膏，将稠膏置于减压真空干燥箱中，设置真空度为-0.05～-0.08MPa，温度为70℃，真空干燥36小时，得到干膏，将干膏置于万能粉碎机中进行粉碎，过100目筛，得到浸膏粉，备用。

3、碳化

将玉米秸秆、甘蔗皮混合粉碎，过10目筛，得到玉米秸秆与甘蔗皮的混合粉末，加入提取步骤收集的滤饼，混合均匀，置于真空碳化炉中，设置真空度为-30～-50pa，设置碳化温度为300℃，保温3小时，自然冷却，收集碳化后物料，备用；所述玉米秸秆与甘蔗皮的质量比为2:3，所述玉米秸秆与甘蔗皮的混合粉末与滤饼的质量比为10:2。

4、发酵

首先是将上述制得的碳化混合粉末置于发酵罐中，加入纯化水，搅拌均匀，加入乳酸乳球菌和地衣芽孢杆菌，设置发酵温度为28℃，发酵10天，第一段发酵结束，然后加入绿色木霉菌、白蚁链霉菌，保持发酵温度为28℃，继续发酵35天，发酵结束，过滤，收集发酵液，备用；所述碳化混合粉末与纯化水的质量比为1:2，所述碳化混合粉末、乳酸乳球菌、地衣芽孢杆菌、绿色木霉菌、白蚁链霉菌的活菌数质量比为100：0.15:0.15:0.25:0.25。

5、混合干燥

取上述制得的发酵液，加入山梨醇并搅拌溶解，再加入上述制得的浸膏粉，继续搅拌至分散均匀，分装至100ml玻璃瓶中，然后置于冷冻干燥箱中，迅速将温度冷冻至-35℃，保持150分钟，然后抽真空干燥，以8℃/小时升温速率升温至-10℃，恒温保持120分钟；再以8℃/小时升温速率升温至0℃，0℃恒温450分钟；再以8℃/小时升温速率升温至10℃，恒温保持420分钟，以8℃/小时升温至30℃，恒温120分钟，干燥结束，取出产品，经检测产品水分为5.2％，即得；所述发酵液、山梨醇、浸膏粉的质量比为100:150:10。

实施例4：

本发明对叶点霉菌的抑菌效能对比试验：

对比样品1：为实施例1的发酵方法制得的发酵液干燥后的产品，即相对于实施例1不加入提取的浸膏粉制得的样品。

对比样品2：为实施例1的提取方法制得的浸膏粉，即相对于实施例1不加入发酵液制得的样品。

对比样品3：为实施例1的提取方法制得的浸膏粉，只是取消碳化步骤，具体方法是将购于巩义市金辉滤材有限公司的粉末活性炭同滤饼混合，粉末活性炭与滤饼的质量比为10:4，再按实施例1的方法进行后续发酵步骤、混合干燥步骤制得的样品。

培养基：以葡萄糖50g、蛋白胨30g、琼脂40g、蒸馏水2000ml，混合均匀后，作为培养基。

方法：将实施例1、实施例2、实施例3、对比样品1、对比样品2、对比样品3制得的产品按质量比1:100加入纯化水稀释，分别加入上述培养基中，搅拌均匀，加入叶点霉菌菌液1ml(约含菌数为300个)，充分搅拌，室温放置培养5天，逐日观察生长情况，并进行叶点霉菌计数，其结果见下表：

备注：表格中“——”表示未检出。

由以上结果可知，本发明实施例1、实施例2、实施例3制得的产品对叶点霉菌的抑菌能力明显强于对照样品1和对照样品2，实施例1、实施例2、实施例3室温放置培养到第4天，叶点霉菌就无法检出，即表明利用本发明制得的药剂，4天可灭杀叶点霉菌，而对比样品1、对比样品2，室温培养5天后，仍旧可以检出叶点霉菌，表明本发明发酵液与提取浸膏抑菌能力协同增效，具有灭杀的性能，而对比样品3抑制叶点霉菌的性能强于对比样品1和对比样品2，但相较于本发明实施例1、2、3的抑制叶点霉菌的能力弱，表明本发明碳化过程对最终产品的抑菌效果具有积极的作用，故，本发明对猕猴桃感染叶点霉菌引起的早期落叶病有效。

实施例5：

本发明用于猕猴桃早期落叶病的药剂存放稳定性考察试验：

放置条件：于温度25℃，相对湿度60％。

试验样品：

样品1：实施例1制得的样品。

样品2：实施例2制得的样品。

样品3：实施例3制得的样品。

样品4(对比样)：按实施例1的制备方法，只是混合过程不添加山梨醇，直接混合均匀后，进行冷冻干燥，得到的产品。

试验方法：放置12个月，取样观察性状和对叶点霉菌的抑菌性能(抑菌性能试验按实施例4的方法进行)，并与刚制备出的产品进行对比，具体结果见下表。

以上试验结果表明，本发明在未加山梨醇所制得的产品，放置过程容易变色，并且抑菌性能明显下降，而本发明可放置12个月，依旧保持原有的抑菌能力，因此，本发明产品至少12个月内，依旧具有较强抑菌能力。