一种HPLC法测定马来酸桂哌齐特中间体中氯乙酸残留检测方法

摘要

本发明属于氯乙酸检测技术领域，尤其涉及一种HPLC法测定马来酸桂哌齐特中间体中氯乙酸残留检测方法，包括如下步骤：(1)对照品溶液的配制；(2)样品溶液的配制；(3)在HPLC中进样检测；色谱检测条件为：色谱柱：硅烷键合硅胶柱为固定相的高效液相色谱柱，流动相A：水‑甲醇‑三氟乙酸，体积比为96:4:0.1，流动相B：甲醇，流动相流速：0.6‑1ml/min，色谱柱柱温：33‑37℃，进样量为20μl，检测波长：212‑216nm；(4)氯乙酸含量的计算：按外标法以峰面积计算氯乙酸的含量。本发明的有益效果是：实现使用HPLC方法对氯乙酸进行检测，操作简单，并克服了现有技术的难题。

说明书

技术领域

本发明属于氯乙酸检测技术领域，尤其涉及一种HPLC法测定马来酸桂哌齐特中间体中氯乙酸残留检测方法。

背景技术

马来酸桂哌齐特化学名为：(E)-1-{4-[(3',4',5'-三甲氧基肉桂酰基)]1-1哌嗪}乙酰吡咯啶顺丁烯二酸盐，可用于治疗脑血管疾病、心血管疾病，其常含有杂质氯乙酸，氯乙酸属于基因毒性杂质中的一种。基因毒性杂质是指能直接或者间接损害DNA，导致基因突变或具有致癌倾向的位置。氯乙酸是马来酸桂哌齐特中间体合成过程中使用到的原料之一，本发明通过严格控制氯乙酸在马来酸桂哌齐特中间体中的含量，来进一步保证药物的安全性。

近年来，EMEA、FDA、ICH等相继发布了针对基因毒性杂质的指导原则。基因毒性杂质限度要求很低，其分析检测的难度较大。高效液相色谱法是药物分子中最常用的分离分析手段，但是对于氯乙酸这种紫外吸收很弱的杂质，其检测灵敏度较低。对于含N的卤代烃，通常采用液质联用技术进行测定，但其流动相不能含有非挥发性的缓冲盐，以及TFA、三乙胺等试剂。衍生化法也常用于卤代烃的检测，但其操作较为繁琐。

中国专利CN 110988151A在背景技术中指出，由于氯乙酸的沸点低、分子量小、紫外吸收弱且含碳氢比例少，很难用常用的检测方法GC-FID、HPLC-UV、GC-MS检测试样中氯乙酸低浓度限量。因此提供了一种应用超高效液相色谱-串联质谱检测氯乙酸的方法，包括如下步骤：步骤(1)，取待测样品置于容量瓶中，加入乙腈-水1:1～9:1定容到10～50ml，涡旋混合5～15min，超声提取5～15min，过0.22μm滤膜，进样对样品中氯乙酸进行检测；步骤(2)，采用超高效液相色谱-串联质谱联用仪UPLC-MS/MS作为检测仪器对氯乙酸进行检测。该技术通过使用UPLC-MS/MS能够简单、快捷高效的对药品原料药、农用化学品及食品中氯乙酸进行定性和定量检测。但是，该检测方法对仪器要求高，需要液相色谱与质谱联用，操作过程繁琐复杂。

本发明通过对样品进行前处理，利用HPLC法即可完成低浓度氯乙酸的检测，突破了现有技术不能用HPLC检测药物中氯乙酸含量的难题。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，本发明提供一种HPLC测定氯乙酸残留的检测方法，该方法通过对待测样品进行良溶剂的溶解和不良溶剂的沉淀析出实现氯乙酸的提取，进而实现使用HPLC方法对氯乙酸进行检测，操作简单，并克服了现有技术的难题。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种HPLC法测定马来酸桂哌齐特中间体中氯乙酸残留检测方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)氯乙酸对照品溶液的配制：取氯乙酸对照品适量，精密称定，加水稀释至浓度为5μg/ml；

(2)样品溶液的配制：精密称定样品，加入乙腈使其完全溶解，配制200mg/ml的样品溶液，加水稀释至样品浓度为80mg/ml，使样品析出，涡旋离心取上清液；

(3)样品检测：将步骤(1)和(2)得到的溶液在HPLC中进样检测；

其中，色谱检测条件为：色谱柱：硅烷键合硅胶柱为固定相的高效液相色谱柱，流动相A：水-甲醇-三氟乙酸，体积比为96:4:0.1，流动相B：甲醇，流动相流速：0.6-1ml/min，色谱柱柱温：33-37℃，进样量为20μl，检测波长：212-216nm；

(4)氯乙酸含量的计算：按外标法以峰面积计算氯乙酸的含量。

作为本发明的优选，所述步骤(1)中，氯乙酸对照品溶液的配制过程为：取氯乙酸对照品约5mg，精密称定，置100ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，精密移取1.0ml至10ml量瓶，加水稀释至刻度，即得。

作为本发明的优选，所述步骤(2)中，样品溶液的配制过程为：精密称定样品80mg，置于1.5ml EP管中，加入400μl乙腈，涡旋使其完全溶解，加600μl水，涡旋离心取上清液。

作为本发明的优选，使用的色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C8色谱柱，规格为4.6*150mm，填料粒径3.5μm。

作为本发明的优选，流动相流速为：0.8ml/min，色谱柱柱温：35℃，检测波长：214nm。

本发明的有益效果是：本发明利用产品与杂质的溶解度差异，首先使用少量良溶剂(乙腈)将产品完全溶解，然后向溶液中加入不良溶剂(水)使产品大量析出。与此同时，由于产品中氯乙酸由于含量极低，产品大量析出的同时，氯乙酸仍溶解在溶液中，不会影响产品中氯乙酸含量的检测，氯乙酸的提取率可达92.6％，由此测得的氯乙酸含量准确可靠，且本发明检测方法的准确性经专属性、定量限与检出限、精密度等试验验证。本发明在降低样品的实际浓度的同时也保证了不会损失待测杂质，使得利用HPLC法即可完成低浓度氯乙酸(62.5ppm)的检测，该检测方法操作简单，检测速度快、分析时间短、检测结果准确性高，克服了现有技术不能用HPLC检测药物中氯乙酸含量的难题。

附图说明

图1为本发明氯乙酸对照品色谱图；

图2为本发明马来酸桂哌齐特中间体溶液色谱图；

图3为本发明马来酸桂哌齐特中间体加标溶液色谱图；

图4为本发明专属性稀释剂色谱图；

图5为本发明专属性氯乙酸对照品色谱图；

图6为本发明专属性马来酸桂哌齐特中间体样品溶液色谱图；

图7为本发明专属性马来酸桂哌齐特中间体样品加标溶液色谱图；

图8为本发明氯乙酸定量限色谱图；

图9为本发明氯乙酸检出限色谱图；

图10为本发明氯乙酸线性图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明作进一步地详细描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

一、本发明使用的仪器：HITACHI高效液相色谱仪

配置：四元泵，UV检测器，在线脱气系统，自动进样器，Agilent OpenLab数据处理系统。

二、本发明HPLC分析方法的测试条件

(1)色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C8，4.6*150mm，3.5μm；

(2)色谱条件：以水-甲醇-三氟乙酸(96:4:0.1)为流动相A，甲醇为流动相B，流速为每分钟0.8ml，柱温为35℃；检测波长为214nm，照下表进行梯度洗脱：

三、本发明使用的试剂与试药

甲醇：色谱纯；上海星可高纯溶剂有限公司(CINC)；Lot NO：0212181102；

超纯水：Milli-Q纯水仪自制；

三氟乙酸：色谱纯；CNW；lot:Q251K070；

氯乙酸：深圳卓越生物科技有限公司(SZEB)；批号：LT80S56，纯度(HPLC)98.82％；

马来酸桂哌齐特中间体：由山西诺成制药有限公司提供。

下面结合实施例对发明的方法及其准确度、重复性、精密度、耐用性等进行验证。

实施例1样品中氯乙酸含量的检测

根据马来酸桂哌齐特中间体的使用量计算得到氯乙酸在本品中的限度要求为62.5ppm。使用HPLC法检测本品中氯乙酸残留量，氯乙酸对照品溶液浓度为5μg/ml时信噪比为33，将其作为100％限度水平溶液，根据其限度要求不得过62.5ppm，样品浓度为80mg/ml。如此高浓度的样品浓度，会极大的损害仪器和色谱柱寿命，应尽可能降低进样浓度。本品在水中溶解度低，在乙腈中溶解度高达200mg/ml，因此利用本品的溶解度差异，首先使用少量良溶剂(乙腈)将样品完全溶解，然后向溶液中加入不良溶剂(水)使大量样品析出。与此同时，由于样品中氯乙酸含量极低，样品大量析出的同时，氯乙酸仍溶解在溶液中，不会影响样品中氯乙酸含量的检测。

本发明提供的HPLC法测定马来酸桂哌齐特中间体中氯乙酸残留检测方法，包括如下步骤：

(1)氯乙酸对照品储备液(50μg/ml)的配制：取氯乙酸对照品5.210mg，精密称定，置100ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

(2)氯乙酸对照品溶液的配制：精密量取氯乙酸对照品储备液1.0ml，置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。

(3)样品溶液的配制：精密称定样品80.2mg，置于1.5ml EP管中，加入400μl乙腈，涡旋使其完全溶解，加600μl水，涡旋离心取上清液；

(4)样品加标溶液的配制：精密称定样品80.8mg，置于1.5ml EP管中，加入300μl乙腈，涡旋使其完全溶解，加100μl氯乙酸对照品储备液，再加入600μl水，涡旋离心取上清液；

(5)样品检测：将步骤(2)、(3)和(4)得到的上清液在HPLC中进样检测；

其中，色谱检测条件为：色谱柱：硅烷键合硅胶柱为固定相的高效液相色谱柱，流动相A：水-甲醇-三氟乙酸，体积比为96:4:0.1，流动相B：甲醇，流动相流速：0.8ml/min，色谱柱柱温：35℃，进样量为20μl，检测波长：214nm；

(6)氯乙酸含量及提取率的计算：按外标法以峰面积计算氯乙酸的含量及提取率。

得到的氯乙酸对照品色谱图、马来酸桂哌齐特中间体溶液色谱图、马来酸桂哌齐特中间体加标溶液色谱图分别如图1～3所示，结果表明，样品溶液在氯乙酸出峰位置处无干扰，样品加标溶液中氯乙酸与相邻峰的分离度为2.1，满足要求。按外标法以峰面积计算样品中氯乙酸含量及提取率。样品中氯乙酸含量计算公式如下：

A样品为样品溶液中氯乙酸的峰面积；

A对照为对照品溶液中氯乙酸的峰面积；

C对照为对照品溶液中氯乙酸的浓度；

V为样品溶液的配制体积，ml；

m样品为样品称样量，mg。

检测结果见下表。

样品中氯乙酸含量及提取率结果

备注：由于样品中未检出氯乙酸，提取率公式可简化为：提取率(％)＝样品加标峰面积/对照品峰面积×100％。

从表中可以得出，样品中未检出氯乙酸，氯乙酸提取率为92.6％，按照此处理方法，样品在良溶剂中溶解后通过加入不良溶剂使主成分大量析出，而杂质由于浓度低，仍保留在溶液中。回收率实验结果证明此前处理方法适用于本品中残留的氯乙酸含量测定。

实施例2专属性实验

考察稀释剂、样品溶液其它成分对氯乙酸色谱峰是否干扰。

氯乙酸对照品储备液(50μg/ml)：取氯乙酸对照品约5mg，精密称定，置100ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

氯乙酸对照品溶液：精密量取氯乙酸对照品储备液1ml，置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。

样品溶液：精密称定样品81.7mg，置1.5ml EP管中，加入400μl乙腈，涡旋使其完全溶解，加600μl水，涡旋，离心取上清，即得。

样品加标溶液：精密称定样品82.5mg，置1.5ml EP管中，加入300μl乙腈，涡旋使其完全溶解，加100μl氯乙酸对照品储备液(50μg/ml)，再加入600μl水，涡旋，离心取上清，即得。

取稀释剂(乙腈：水＝4：6)、氯乙酸对照品溶液、样品溶液和样品加标溶液各20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，得到的色谱图如图1-4所示，并将专属性试验结果列于表1。

从图1-4及表1可以看出，空白溶剂与样品溶液在氯乙酸出峰位置处均无色谱峰，样品加标溶液中氯乙酸与相邻峰的最小分离度为2.2，大于1.5，符合可接受的标准。其中，可接受的标准为：稀释剂在氯乙酸出峰位置处应无干扰；样品中如有其它化合物峰应与氯乙酸色谱峰能完全分离，分离度应不低于1.5。

表1专属性试验结果

实施例3系统精密度实验

取浓度为5μg/ml氯乙酸对照品溶液连续进样6次，记录色谱图，计算氯乙酸峰面积RSD。将连续6次进样得氯乙酸峰面积RSD列于表2，从表2中可知，氯乙酸峰面积RSD为1.0％，小于4％。因此，本方法系统精密度良好。

表2系统精密度结果

实施例4定量限(LOQ)与检出限(LOD)

参考系统精密度中对照品溶液氯乙酸色谱峰的信噪比，以及LOD信噪比要求(3～5)和LOQ信噪比要求(9～15)，配制相应浓度溶液，考察其定量限和检出限。

LOQ溶液配制：精密称定氯乙酸对照品5.333mg，置100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取0.4ml，置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为定量限溶液。

表3氯乙酸定量限试验结果

取LOQ溶液连续进样6次，记录色谱图，如图5所示，氯乙酸定量限试验结果见表3，由此可知，峰面积RSD为1.5％小于4％，S/N在11～12之间。结论：本方法氯乙酸定量限为2.11μg/ml，约相当于样品检测浓度的26.4ppm。

LOD溶液配制：精密称定氯乙酸对照品5.333mg，置100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取0.2ml，置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为检出限溶液。

取LOD溶液连续进样3次，记录色谱图，如图6所示，氯乙酸检出限试验结果见表4，从表中可知，氯乙酸信噪比均为3，本方法氯乙酸检出限为1.05μg/ml，约相当于样品检测浓度的13.1ppm。

表4氯乙酸检出限试验结果

实施例5线性与范围

配制浓度分别为2.11μg/ml、3.16μg/ml、4.22μg/ml、5.27μg/ml、7.91μg/ml和10.54μg/ml的氯乙酸对照品溶液，将不同浓度的溶液由低到高依次进样，每个浓度水平溶液进样分析2次，线性最低点为LOQ溶液，LOQ峰面积为6针的平均峰面积，以氯乙酸浓度为横坐标，平均峰面积为纵坐标，进行线性回归，得到的氯乙酸线性图如图7所示，氯乙酸线性浓度和峰面积结果列于表5中，得到的氯乙酸线性方程为y＝2762.2x–260.49，相关系数r＝0.99998>0.999。由此可知，氯乙酸在2.11～10.54μg/ml的浓度范围内线性关系良好。

表5氯乙酸线性浓度和峰面积结果

实施例6准确度实验

分别制备低、中、高3个不同浓度的供试品加标溶液，每种浓度分别制备3份供试品加标溶液考察方法的准确度。

氯乙酸对照品储备液：精密称取氯乙酸对照品5.179mg，置100ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

氯乙酸对照品溶液：精密量取氯乙酸对照品储备液1ml，置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。

样品溶液和样品加标溶液按表6配制。

表6准确度样品和样品加标溶液配制表

取氯乙酸对照品溶液、样品溶液和样品加标溶液进样分析，按外标法以峰面积计算各水平加标溶液中氯乙酸回收率。得到的氯乙酸准确度试验结果如表7所示，从表7可知，各加标水平平均回收率在88.2％～89.2％之间，且RSD均小于4％，因此本发明的检测方法准确度良好。

表7氯乙酸准确度试验结果

(注：样品溶液中未检测中氯乙酸。)

实施例7中间精密度实验

由不同实验人员不同日期用已建立的分析方法，制备6份中浓度的供试品加标溶液，考察方法的准确度。

氯乙酸对照品储备液：精密称取氯乙酸对照品5.268mg，置100ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

氯乙酸对照品溶液：精密量取氯乙酸对照品储备液1ml，置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。

样品溶液和样品加标溶液按照表8进行配制。

表8中间精密度样品及样品加标溶液配制

取氯乙酸对照品溶液、样品溶液和样品加标溶液进样分析，记录色谱图，按外标法以峰面积计算回收率。将得到的中间精密度试验结果列于表9，从表9的数据可知，6份供试品加标回收率RSD为1.8％，说明本发明的检测方法中间精密度良好。

表9中间精密度试验结果

实施例8耐用性实验

参考氯乙酸检测液相色谱方法，适度改变方法，调整柱温±2℃、流速±0.1ml/min和波长±2nm情况下，验证本发明的检测方法是否适用。

由于样品中未检测出氯乙酸，用样品加标溶液作为耐用性测试溶液，计算氯乙酸含量(相当于样品)，配制氯乙酸对照品溶液和样品加标溶液，在不同耐用性条件下，分别进样分析，记录色谱图，按外标法以峰面积计算氯乙酸含量。调整柱温±2℃、流速±0.1ml/min和波长±2nm情况下得到的耐用性试验结果分别见表10-12，由表10-12的数据可知，在改变本发明检测方法的柱温(35±2℃)、流速(0.8±0.1ml/min)和波长(214±2nm)条件下，氯乙酸与相邻峰最小分离度均大于1.5，含量RSD值均小于10％。说明本发明的检测方法耐用性良好。

表10柱温(35±2℃)耐用性试验结果

表11波长(214±2nm)耐用性试验结果

表12流速(0.8±0.1ml/min)耐用性试验结果

以上对本发明的实例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。