一种基于CRISPR Cpf1的枯草芽孢杆菌多基因编辑和表达调控系统

摘要

本发明公开了一种基于CRISPR Cpf1的枯草芽孢杆菌多基因编辑和表达调控系统。本发明通过构建的Cpf1表达载体pHT‑XCR6和crRNA阵列表达载体pcrF11，可以一次性完成2个基因的完全敲除，6个基因的碱基修饰以及1个基因的敲入。载体pHT‑XCR6上包含NgAgo蛋白，用于促进recA介导的同源重组。同时构建了载体pLCg6‑dCpf1‑remA(用于将DNA酶失活的Cpf1突变体dCpf1和转录激活因子remA的融合蛋白在枯草芽孢杆菌基因组上的整合表达)和pcra3(用于crRNA阵列在枯草芽孢杆菌基因组上的整合表达)，可以用于同时对不同基因进行转录抑制和激活。本发明还建立一种经济高效的名为SOMACA(Synthetic Oligos Mediated Assembly of crRNA Array)的crRNA阵列组装方法，可通过合成短单链DNA(<60nt)将所需的crRNA阵列插入到载体pcrF11或pcra3上，用于引导Cpf1或dCpf1‑remA进行基因编辑和表达调控。