基于CRISPR/Cas9的水稻多基因编辑及其在育种中的应用

摘要

随着水稻基因组测序的完成，阐明水稻重要基因功能的研究也日渐迫切。利用ZFN、TALEN基因编辑技术已经实现了单个基因的定向敲除，但是对于家族基因的功能分析、基因之间的相互作用、多基因调控同一个复杂农艺性状的阐明则需要多基因突变体进行研究。虽然可以利用传统的杂交方法获得多基因突变体，但是品种间基因渗透和连锁使得之后的筛选工作量加大。近年来发展起来的CRISPR/Cas9基因编辑技术能定向的突变基因，避免了传统多突变体获得过程中的基因连锁和基因渗透现象。因此，利用CRISPR/Cas9多基因编辑技术获得多个基因共敲除突变体不仅对水稻基因功能研究有重大意义而且在水稻育种中有很大的应用价值。
　　本研究在已有的CRISPR/Cas9系统上建立了水稻中CRISPR/Cas9多基因敲除系统，并对该多基因敲除系统进行优化，利用优化过的多基因编辑系统进行水稻中多基因编辑实验。主要研究结果如下:
　　一、CRISPR/Cas9介导的水稻单基因敲除
　　在前人CRISPR/Cas9系统的基础上，以单敲除水稻OsMKK4基因为例，通过CRISPR/Cas9系统构建双元表达载体pC1300-Cas9-gMKK4，利用农杆菌介导的方法将表达载体转化中花11品种。T0代株系进行PCR扩增/酶切实验，结果表明36株转基因阳性株系中，有29株靶位点发生突变，突变效率为80.56‰其中19个株系为纯合突变株;10个株系为杂合突变株。进一步测序结果表明，获得的突变类型为碱基插入和碱基缺失，且大部分株系为移码突变株。即利用CRISPR/Cas9系统在水稻中能高效的获得单基因敲除突变体。
　　二、CRISPR/Cas9介导的水稻多基因敲除系统的建立
　　1.为了简化sgRNAs组装到pC1300-Cas9载体的步骤，我们在中间载体SK-gRNA多克隆位点1对(BamHⅠ和BglⅡ)同尾酶的基础上引入另外两对同尾酶(XbaⅠ和NheⅠ，XhoⅠ和SalⅠ)，命名为SK-4G。优化过的系统能通过一个连接反应同时将1-3个靶位点同时连入一个中间载体SK-4G或者表达载体pC1300-Cas9。
　　2.利用优化过的CRISPR/Cas9多基因敲除系统将水稻3个基因(OsPDS、Os02923823和OsMPK2)的sgRNAs通过一轮克隆连入双元表达载体中，并通过一个遗传转化实验获得110株T0代转基因阳性株。
　　3.通过PCR扩增/酶切实验和测序结果表明，共敲除的三个基因OsPDS、Os02923823和OsMPK2的突变效率分别为68.2％，66.4％和81.0％。并且gRNA靶位点表现出碱基插入、碱基缺失和碱基序列微同源重组等不同的基因突变类型，说明不同的gRNA靶位点之间的突变是相互独立的。本研究结果表明我们的CRISPR/Cas9多基因敲除系统能快速、高效的获得多基因敲除突变体。
　　三、CRISPR/Cas9介导的水稻8个基因的共敲除
　　1.为了验证实验室建立的CRISPR/Cas9多基因敲除系统敲除基因的潜力，我们利用该系统构建了共敲除水稻中8个农艺性状相关基因（3个穗型基因DEP1，EP3和Gn1a、2个粒形基因GS3和GW2、一个株型基因LPA1、一个香味基因BADH2和一个生育期基因Hd1)的表达载体，命名为pC1300-Cas9-gDEP1-gGn1a-gGW2-gEP3-gBADH2-gLPA1-gGS3-gHd1。本实验将sgRNAs与Cas9蛋白共转化水稻原生质体系统，接着用PCR/RE的方法检测8个基因的突变情况，结果表明8个基因在水稻原生质体瞬时表达系统中都发生了基因突变，并且sgRNAs串联的个数并不影响CRISPR/Cas9系统基因编辑的频率，同时也从体外实验证明了我们设计的靶序列能够成功的指导Cas9蛋白发挥其切割DNA双链的功能。
　　2.通过农杆菌介导的方法将双元表达载体转化日本晴品种，T0代获得36株转基因阳性苗。测序结果表明，8个靶向基因EP3、GS3、GW2、BADH2、DEP1、Gn1a、LPA1和Hd1的突变频率分别为50％、100％、67％、81％、83％、97％、67％和78％。进一步分析每个靶向基因的基因型，我们发现了25种不同基因组合模式的多基因敲除突变体，甚至包括2株8基因共敲除纯合突变株。说明优化过的CRISPR/Cas9系统在水稻中敲除效率高。
　　3.利用NCBI BLAST工具对8个靶序列进行特异性分析，结果发现BADH2、DEP1和EP3基因有潜在的脱靶位点，且测序结果表明BADH2、DEP1和EP3基因的突变频率分别为0％、11.1％和5.6％，说明该系统有较低的脱靶率。
　　4.通过对T0代突变株的表型鉴定，发现除了未做处理的生育期基因，获得的其他基因突变株的表型与预期符合。说明CRISPP/Cas9多基因编辑技术可以获得背景一致的多达8基因共敲除的突变株。
　　四、CRISPR/Cas9介导的水稻产量相关QTL的编辑
　　1.利用CRISPR/Cas9多基因敲除系统构建共敲除水稻重要产量QTL基因GS3和Gn1a的表达载体，并通过农杆菌介导的方法将双元表达载体转化5个江浙地区广泛种植的水稻栽培品种，南粳9108、武运粳27、扬粳4227、浙粳22和浙粳88。对T0代株系靶位点测序分析，测序结果表明基因突变的类型主要有碱基插入和碱基缺失，由于GS3基因靶位点突变频率达到100％，我们只获得gs3单突突变体和gs3gn1a双突突变体，并未获得gn1a单突突变体。因此，在5个水稻品种中仅筛选出10个水稻株系(gs3-N9108和gs3gn1a-N9108，gs3-W27和gs3gn1a-W27,gs3-Y4227和gs3gn1a-Y4227,gs3-Z22和gs3gn1a-Z22,gs3-Z88和gs3gn1a-Z88)。
　　2.转基因T1代水稻株系产量性状的调查结果表明在10个新株系材料中，其中有3个表现为单株产量增加，7个表现为单株产量降低，并且我们在T1代株系中成功分离出无选择标记基因的突变株系。水稻产量由有效穗数（或有效分蘖数）、每穗实粒数、千粒重和结实率四个因素所构成。为解析QTL编辑导致产量变化的原因，我们将有效分蘖细分为有效大分蘖和有效小分蘖。进一步统计分析表明:QTL编辑导致了单株有效大分蘖数目的变化，而单株有效大分蘖数目的变化直接决定了最终的单株产量的变化。
　　3.进一步对10个材料配套合理的栽培措施，T2代考察了其中3个品种的分蘖数和产量，结果与预期基本相符合，除了gs3gn1a-Y4227株系，合理的栽培措施使得新株系的产量增加。这些研究为利用该技术进行水稻育种研究提供实践参考。

目录

摘要

符号说明

第1章 文献综述及研究背景

1．1 水稻基因组与功能基因组学研究基础

1．2 水稻突变体的获得

1．3 基因组编辑技术的发展及应用前景

1．3．1 锌指核酸酶(ZFN)

1．3．2 类转录激活效应因子核酸酶(TALEN)

1．3．3 CRISPR／Cas9系统

1．3．4 CRISPR／Cas9与ZFN和TALEN比较

1．4 CRISPR／Cas9系统在植物中的发展与应用

1．4．1 单基因、多基因敲除

1．4．2 靶位点的特异性和脱靶率

1．4．3 后代突变体的筛选

1．4．4 基因组编辑植物的生物安全性

1．5 研究目的和意义

1．6 本研究的技术路线

2．1 前言

2．2 实验材料

2．2．1 植物材料

2．2．2 菌株和载体

2．2．3 实验试剂

2．2．4 常用培养基及生化试剂配制

2．3 实验方法

2．3．1 单基因敲除的sgRNA设计与表达载体的组装

2．3．2 水稻DNA提取

2．3．3 转基因及转基因阳性株的获得

2．3．4 突变体的筛选与鉴定

2．4 结果与讨论

2．4．1 转基因阳性苗的获得

2．4．2 突变株突变类型分析

2．5 小结

第3章 CRISPR／Cas9介导的水稻多基因敲除系统的建立

3．1 前言

3．2 实验材料

3．2．1 植物材料

3．2．2 菌株和载体

3．2．3 实验试剂

3．2．4 常用培养基及生化试剂配制

3．3 实验方法

3．3．1 多基因敲除的sgRNA的改造

3．3．2 多基因敲除的sgRNA设计与表达载体的组装

3．3．3 水稻DNA提取

3．3．4 转基因及转基因阳性株的获得

3．3．5 突变体的筛选与鉴定

3．4 结果与讨论

3．4．1 转基因阳性株的获得

3．4．2 突变株突变类型分析

3．5 小结

第4章 CRISPR／Cas9介导的水稻8个基因共敲除

4．1 前言

4．2 实验材料

4．2．1 植物材料

4．2．2 菌株和载体

4．2．3 实验试剂

4．2．4 常用培养基及生化试剂配制

4．3 实验方法

4．3．1 水稻8基因共敲除的靶位点设计

4．3．2 水稻8基因共敲除的sgRNA与表达载体组装

4．3．3 水稻原生质体转化

4．3．4 水稻DNA提取

4．3．5 转基因及转基因阳性株的获得

4．3．6 突变体的筛选与鉴定

4．3．7 田间主要农艺性状调查

4．4 结果与讨论

4．4．1 水稻原生质体中基因的敲除效率

4．4．2 T0代突变效率和突变类型分析

4．4．3 靶位点脱靶分析

4．4．4 T0代突变株的表型鉴定和分析

4．5 小结

第5章 CRISPR／Cas9介导的水稻产量相关QTL编辑

5．2．2 菌株和载体

5．2．3 实验试剂

5．2．4 常用培养基及生化试剂配制

5．3 实验方法

5．3．1 水稻产量QTLs靶位点设计

5．3．2 水稻产量QTLs敲除的sgRNA与表达载体组装

5．3．3 水稻DNA提取

5．3．4 转基因及转基因阳性株的获得

5．3．5 突变体的筛选与鉴定

5．3．6 T1代无选择标记基因突变株的获得

5．3．7 田间主要农艺性状调查

5．3．8 水稻小区实验

5．4 结果与讨论

5．4．1 转基因阳性株的获得

5．4．2 突变株突变类型分析

5．4．3 新基因型突变株的获得及其产量性状的研究

5．5 小结

6．1 总结

6．2 CRISPR／Cas技术的展望

参考文献

附录

致谢

攻读学位期间发表的学术论文

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